歐陽(yáng)金旭 (長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

熊 濤 (長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

楊玉瑩 (長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

豬鸚鵡熱衣原體的分離與鑒定

歐陽(yáng)金旭 (長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

熊 濤 (長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

楊玉瑩 (長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

以新鮮豬糞便為材料，采用雞胚分離培養(yǎng)法從荊州地區(qū)的豬群中分離出 4株鸚鵡熱衣原體 ，通過(guò)光學(xué)顯微鏡檢查、藥敏試驗(yàn)、碘染試驗(yàn)和動(dòng)物致病性試驗(yàn)對(duì) 4株衣原體進(jìn)行了鑒定 。結(jié)果表明 ，所分離的4株衣原體均為鸚鵡熱衣原體。

豬群；鸚鵡熱衣原體；雞胚；分離培養(yǎng)；鑒定

衣原體是衣原體科衣原體屬的嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生微生物。最新研究認(rèn)為，衣原體屬有4個(gè)種，即沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)、 鸚 鵡 熱 衣 原 體 (C.psittaci)、肺炎衣原體 (C.pnewnonioe)和反芻動(dòng)物衣原體 (C.pecorum)。動(dòng)物衣原體病主要是由鸚鵡熱衣原體及反芻動(dòng)物衣原體引起的一種多癥候傳染病。鸚鵡熱衣原體可感染禽類引起禽衣原體病，名鸚鵡熱或鳥疫，也感染其他脊椎動(dòng)物如牛、豬、山羊、綿羊等。反芻動(dòng)物衣原體目前只從哺乳動(dòng)物分離到，如牛、綿羊、山羊、樹袋熊(Koala)、豬[1]。盧國(guó)棟等[2]報(bào)道豬衣原體對(duì)四環(huán)素類抗生素、紅霉素、夾竹桃霉素、泰樂(lè)菌素、強(qiáng)力霉素、氯霉素及螺旋霉素敏感，對(duì)慶大霉素、新霉素、鏈霉素及磺胺嘧啶鈉不敏感。衣原體含有DNA和RNA，以二分裂方式增殖，在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可形成包涵體，易被堿性染料著染。用Giemsa、Gimenez、Ziehl/Neelsen、Macchiavello、Castameda等染色法著色良好。能在雞胚和McCoy細(xì)胞、鼠L細(xì)胞、Hela細(xì)胞、Vero細(xì)胞、BHK21細(xì)胞、BGM細(xì)胞、Chang氏人肝細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，繁殖過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生2種大小不同的顆粒，較小的為原生小體(Elementary body，EB)，直徑0.2～0.5μm，呈球形或卵圓形，有傳染性[3]。

20世紀(jì)90年代初期以來(lái)，隨著我國(guó)集約化養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，動(dòng)物衣原體的感染呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。目前最有效的防治動(dòng)物衣原體感染的措施就是接種安全、有效的疫苗。但由于生物學(xué)特性和免疫學(xué)機(jī)制的復(fù)雜性，衣原體感染后寄生于宿主細(xì)胞內(nèi)反而受到宿主細(xì)胞的保護(hù)，目前研制的多種減毒活疫苗、滅活苗是否能很好地誘導(dǎo)特異性免疫力的產(chǎn)生而不引起其他副作用，以及其有效性和穩(wěn)定性等都尚待進(jìn)一步證實(shí)。因此，對(duì)衣原體進(jìn)行分離鑒定十分重要。動(dòng)物衣原體病是一種人畜共患病，禽衣原體病與哺乳動(dòng)物衣原體病比較，前者對(duì)人類健康的危害性更嚴(yán)重[4-5]。做好動(dòng)物衣原體病的防治工作，在一定程度上能保障人民的財(cái)產(chǎn)和人生安全，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，對(duì)國(guó)家“三農(nóng)”政策的實(shí)施具有重大的實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

SPF雞胚由山東無(wú)特定病原雞實(shí)驗(yàn)種雞場(chǎng)提供；新鮮的豬糞便由湖北荊州某豬場(chǎng)采集；衣原體標(biāo)準(zhǔn)株及小牛血清由長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物病原與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 病料的處理

采取豬新鮮糞便，加入5倍稀釋液(0.01mol/L，pH7.4 PBS溶液)混合，再加入慶大霉素100μg/ml，硫酸鏈霉素1mg/ml，兩性霉素10μg/ml，37℃水浴感作1h。于4℃下，500g離心10min，取上清液按1∶10與細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液(即小牛血清)混合，加鏈霉素500μg/ml。4℃下，1500g離心20min。取上清液按1∶5與細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液(同上)混合，4℃下，2000g離心20min，取上清液4℃保存待用。

1.3 衣原體分離培養(yǎng)

(1)雞胚接種 取上述處理后病料以卵黃囊腔接種6～8日齡健康雞胚，每個(gè)雞胚接種0.12ml。逐日觀察雞胚死亡情況，棄去2日內(nèi)死亡雞胚，如果超過(guò)6日內(nèi)雞胚沒(méi)有死亡，則收獲雞胚卵黃囊膜，處理后盲傳3代。

(2)收獲雞胚 收集4～6日齡死亡雞胚，無(wú)菌操作收取雞胚卵黃囊膜，置于無(wú)菌瓶中，另取少量卵黃囊涂片待鏡檢。

(3)染色鏡檢 涂片后自然干燥，然后經(jīng)甲醇固定5min，干燥后用姬姆薩氏染色液染色30～60min。以pH7.2磷酸緩沖液或中性蒸餾水沖洗，待干后在光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況。

1.4 衣原體的鑒定

(1)藥敏試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行。選取硫酸鏈霉素、磺胺嘧碇鈉、青霉素、氯霉素4種抗生素為藥敏材料，分別配制硫酸鏈霉素(1000μg/ml)、磺胺嘧碇鈉(1mg/ml)、青霉素(1000U/ml)、氯霉素(1mg/ml)的PBS液，再分別加入含衣原體的雞胚材料，4℃作用4h，接種雞胚，每株接5個(gè)胚，棄去污染雞胚，其余為試驗(yàn)用雞胚。收集4～6d的死胚涂片檢查,記錄有紅染衣原體顆粒的雞胚與試驗(yàn)用雞胚的數(shù)量。另每株衣原體各設(shè)一組空白對(duì)照，即各株衣原體的組織懸液在4℃放置4h后直接接種雞胚，而不與任何藥物作用，觀察雞胚死亡情況。

(2)碘染試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行。用分離各衣原體株的雞胚卵黃囊膜涂片、火焰固定，以Lugol氏碘液染色10min，觀察包涵體與背景的顏色。

(3)小雞接種試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。選取8～12g健康小雞18只，分成6組，每組3只，1～5組分別接分離的4株衣原體和標(biāo)準(zhǔn)的鸚鵡熱衣原體的卵黃囊懸液；第6組接健康雞胚的卵黃囊懸液。各組腹腔內(nèi)接種病料懸液1ml/只，觀察雞的發(fā)病情況。接種后1周內(nèi)無(wú)異常者，各組剖殺1～2只，取脾、肝制成懸液用雞胚分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 衣原體的分離培養(yǎng)

從病料中共分離出4株衣原體，分別編號(hào)為y-1、y-2、y-3、y-4。病料在6～8日齡雞胚上連續(xù)繼代3～6代后，可使雞胚于接種后4～7d出現(xiàn)規(guī)律性死亡，并表現(xiàn)出典型的病變特征：胚體充血，出血，雞胚的頭、頸、背部有出血斑；卵黃膜變薄，尿囊液清澈，囊膜水腫。

2.2 染色鏡檢觀察

取少許雞胚卵黃囊制成涂片，自然干燥，甲醇固定，磷酸緩沖液沖洗后，在油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，有一較大顆粒被染成藍(lán)紫色，較小顆粒被染成紫紅色(圖1)。這與標(biāo)準(zhǔn)株(圖2)染色結(jié)果對(duì)比相一致。由此可初步表明：分離出來(lái)的病株可能是衣原體。

圖1 衣原體分離株染色鏡檢圖

圖2 衣原體標(biāo)準(zhǔn)株染色鏡檢圖

2.3 衣原體的鑒定

表1 各種藥物與衣原體各株懸液作用后接種雞胚情況

2.3.1 藥敏試驗(yàn)

各種藥物與衣原體懸液作用后接種雞胚，結(jié)果表明，分離衣原體對(duì)磺胺嘧啶鈉和鏈霉素不敏感，而對(duì)青霉素和氯霉素敏感(表1)。

2.3.2 碘染實(shí)驗(yàn)

將各衣原體株感染的雞胚卵黃囊涂片碘染后，包涵體與背景一樣呈淡褐色，結(jié)果均為陰性，說(shuō)明這5株衣原體不含糖原。

2.3.3 小雞接種試驗(yàn)

出于對(duì)試驗(yàn)條件和試驗(yàn)成本的考慮，試驗(yàn)用小雞代替小白鼠作材料，進(jìn)行動(dòng)物致病性實(shí)驗(yàn)。衣原體各株病料懸液接種小雞后，多數(shù)無(wú)明顯癥狀，但試驗(yàn)組小雞出現(xiàn)厭食、精神萎靡、被毛粗亂等現(xiàn)象，而對(duì)照組無(wú)異常。6～7d后各試驗(yàn)組小雞的癥狀均有好轉(zhuǎn)。剖殺后從肝、脾等懸液中分離出了衣原體。由此表明，分離的各衣原體菌株對(duì)小雞有不同程度的致病性。

3 結(jié)論與討論

本研究以發(fā)病或沒(méi)有發(fā)病豬的糞便作衣原體分離，分離的4株衣原體株經(jīng)過(guò)鑒定，其形態(tài)結(jié)構(gòu)符合鸚鵡熱衣原體特征，用姬姆薩氏法染色后，在光學(xué)顯微鏡下可見在淡綠色背景下紅染的針尖大小的衣原體小顆粒。在動(dòng)物試驗(yàn)中，4株衣原體都不能致死小雞，但小雞不同程度地表現(xiàn)出了發(fā)病癥狀，并從小雞都再次分離到了病原。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)青霉素、氯霉素敏感，而對(duì)磺胺、鏈霉素等不敏感。碘染試驗(yàn)為陰性。通過(guò)以上各種鑒定，證明所分離到的4株衣原體為鸚鵡熱衣原體。

進(jìn)入21世紀(jì)，人畜共患疾病成為公共衛(wèi)生關(guān)注的熱點(diǎn)。動(dòng)物衣原體病是由鸚鵡熱衣原體引起的十分重要的自然疫源性疾病。該病人畜共患，呈地方性流行，常造成很大危害及經(jīng)濟(jì)損失。已發(fā)現(xiàn)侵染18個(gè)目、29個(gè)科的190余種鳥類(包括家禽)以及綿羊、山羊、奶牛、牦牛、馬屬動(dòng)物、豬、狗、貓、猴、兔、豚鼠及小鼠等許多哺乳動(dòng)物、野生動(dòng)物和人類，對(duì)人類健康是個(gè)潛在的威脅，是影響人類公共衛(wèi)生的重要疫病之一[9]。目前對(duì)該病的診斷方法較多。實(shí)驗(yàn)室診斷可先采用光學(xué)顯微鏡檢查，其次是采用免疫學(xué)診斷，包括應(yīng)用補(bǔ)體結(jié)合(CF)試驗(yàn)、間接血凝(IHA)試驗(yàn)，免疫熒光試驗(yàn)、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、血凝抑制試驗(yàn)(HI)，變態(tài)反應(yīng)以及衣原體DNA的純化及檢測(cè)技術(shù)等(Grimes J E，Daft B E，Grumbles L C，et al．A manual of methods for laboratory diagnosis of avian chlamydiosis ．Am Assoc Avian Pathol, Kennet t Square，PA，1987．)。

因衣原體病是一種涉及多種家禽、家畜動(dòng)物、野生動(dòng)物和人類的自然疫源性疾病，所以在制定防治措施時(shí)，要考慮患病畜禽對(duì)人感染的威脅，因此在動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)應(yīng)采取以下措施：(1)動(dòng)物飼養(yǎng)生產(chǎn)區(qū)與職工生活區(qū)要嚴(yán)格分開，場(chǎng)內(nèi)入口處應(yīng)設(shè)有消毒，更衣設(shè)備，嚴(yán)禁非工作人員進(jìn)場(chǎng)。(2)定期對(duì)畜禽進(jìn)行血清學(xué)檢查，對(duì)種公畜定期進(jìn)行精液檢查。衣原體CF抗體滴度在1∶8以上或在精液中發(fā)現(xiàn)衣原體者必須淘汰。少數(shù)良種公畜采取隔離用四環(huán)素族抗生素治療1～2個(gè)療程后，再進(jìn)行兩次血清學(xué)檢查為陰性，精液無(wú)衣原體者可留用。(3)如果場(chǎng)內(nèi)經(jīng)常發(fā)生流產(chǎn)、死胎、肺炎、多關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎等疾病更應(yīng)注意，要采取隔離和進(jìn)一步診斷發(fā)病原因，并進(jìn)行治療。(4)在調(diào)運(yùn)種畜禽時(shí)，在飼料中應(yīng)添加土霉素或氯霉素、紅霉素及多種維生素，減少疫病發(fā)生的機(jī)會(huì)。

[1]朱其太．衣原體分類新進(jìn)展[J]．中國(guó)獸醫(yī)雜志，2001，(4)：30-31．

[2]盧國(guó)棟，郭萬(wàn)正．豬衣原體病及其防治[J]．湖北畜牧獸醫(yī)，2002，(2)：26-27．

[3]孔繁德，陳信忠，龔艷清,等．從進(jìn)境大火烈鳥中檢出衣原體病[J]．中國(guó)動(dòng)物檢疫，2001，(11)：39-40．

[4]Calnek B W(高 福，劉文軍，譯)．禽病學(xué)[M]．北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1991．

[5]邱昌慶．禽衣原體病研究進(jìn)展[J]．畜牧獸醫(yī)科技信息，2002，(8)：12-14．

[6]楊宜生，姜天童．豬衣原體病研究初報(bào)[J]．湖北畜牧獸醫(yī)，1982，(2)：2-4．

[7]段躍進(jìn)．豬衣原體病[J]．中國(guó)畜禽傳染病，1991，(1)：62-63．

[8]楊宜生，姜天童．豬衣原體病的病原分離和鑒定[J]．中國(guó)獸醫(yī)雜志，1984，(9)：4-6．

[9]劉振江，羅啟慧．動(dòng)物衣原體病研究現(xiàn)狀[J]．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2004，(2)：29-31.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.03.007

Q93-331

A

1673-1409(2012)03-S024-03

2012-03-07

歐陽(yáng)金旭(1965-)，男，湖北監(jiān)利人，碩士生，研究員，主要從事獸醫(yī)疫病防控研究。