許春紅 郭慧敏 王 軍 李建琦 陳 敏 鄒曉平

南京醫(yī)科大學(xué)附屬鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院消化科1（210008）南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科2

多藥耐藥是惡性腫瘤化療失敗的主要原因。Snai1 為鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail 家族成員之一，研究顯示其可通過(guò)調(diào)控下游靶基因E-鈣黏蛋白（Ecadherin）等的表達(dá)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT），促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[1～3]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)包括Snai1 及其調(diào)控的信號(hào)通路在內(nèi)的EMT 相關(guān)基因與腫瘤耐藥相關(guān)，腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT 可促成腫瘤對(duì)化療耐藥[4～6]。本研究以人工合成microRNA（artificial microRNA,amiRNA）-Snai1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)順鉑（cisplatin,DDP）耐藥的人胃癌細(xì)胞株SGC7901/DDP 以沉默Snai1 基因表達(dá)，通過(guò)觀察SGC7901/DDP 細(xì)胞中Snai1、Ecadherin和耐藥基因切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（ERCC1）蛋白表達(dá)的變化及其對(duì)DDP 敏感性的變化，探討amiRNA-Snai1 逆轉(zhuǎn)SGC7901/DDP 細(xì)胞對(duì)DDP 耐藥性的作用及其可能機(jī)制，為進(jìn)一步明確Snai1 及其調(diào)控的信號(hào)通路在胃癌多藥耐藥中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、腫瘤細(xì)胞株和主要試劑

人中分化胃腺癌細(xì)胞株SGC7901、SGC7901/DDP和amiRNA-Snai1 真核表達(dá)質(zhì)粒為南京醫(yī)科大學(xué)附屬鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院消化科實(shí)驗(yàn)室凍存或構(gòu)建；DDP（齊魯制藥有限公司）；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、殺稻瘟素、熒光二抗、DAPI（invitrogenTM,Life Technologies Corporation）；兔抗人Snai1+Snai2多克隆抗體、小鼠抗人ERCC1 單克隆抗體（Abcam plc.），兔抗人E-cadherin 單克隆抗體（Cell Signaling Technology,Inc.）；CCK-8 試劑盒（日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：SGC7901、SGC7901/DDP 細(xì)胞以含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，常規(guī)消化傳代。SGC7901/DDP細(xì)胞培養(yǎng)基中含終濃度0.1 mg/L 的DDP。

2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建和鑒定：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC7901/DDP 細(xì)胞，參照LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)將amiRNA-Snai1 真核表達(dá)質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中（SGC7901/DDP-amiRNA組和SGC7901/DDP-Mock組），轉(zhuǎn)染24 h 后以殺稻瘟素（5 μg/mL）篩選，采用有限稀釋法將存活細(xì)胞接種于96 孔板培養(yǎng)15 d，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆，以含殺稻瘟素維持濃度2.5 μg/mL 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。蛋白質(zhì)印跡法和免疫熒光法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的Snai1 蛋白表達(dá)，以明確amiRNA的沉默效應(yīng)。

3.CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞存活率：此實(shí)驗(yàn)步驟設(shè)SGC7901/DDP-amiRNA、SGC7901/DDP-Mock、SGC7901/DDP 三組。將細(xì)胞懸液（1×104/mL）接種于96 孔板，200 μL/孔。細(xì)胞貼壁后，棄原培養(yǎng)基，加入含終濃度0.01、0.1、1.0、10.0 mg/L DDP的培養(yǎng)基，另設(shè)不加藥物的對(duì)照組和不接種細(xì)胞、僅加入培養(yǎng)基的調(diào)零孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄含藥培養(yǎng)基，加入新鮮配制的CCK-8 溶液100 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)1 h 后終止培養(yǎng)，于酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處讀取各孔A 值，取3個(gè)復(fù)孔的均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。細(xì)胞存活率=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。繪制不同藥物濃度的細(xì)胞相對(duì)存活率曲線，計(jì)算DDP 對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

4.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Snai1、ERCC1、E-cadherin 蛋白表達(dá)：細(xì)胞以PBS 漂洗，加入細(xì)胞裂解液，冰浴震蕩30 min，4 ℃12 000 r/min 離心10 min（離心半徑7.5 cm），收集上清，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。取30 μg 總蛋白上樣，蛋白變性后電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。分別加入Snai1 一抗（1∶1000 稀釋?zhuān)RCC1一抗（1∶500 稀釋?zhuān)?、E-cadherin 一抗（1∶1000 稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入1∶2000 稀釋的羊抗兔IgG（檢測(cè)Snai1、E-cadherin）或羊抗鼠IgG（檢測(cè)ERCC1），室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL 試劑，暗室曝光，顯影，定影。以α-tubulin（1∶1000 稀釋?zhuān)閮?nèi)參照，應(yīng)用Quantity One 4.4.0 凝膠圖像分析軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

5.免疫熒光法檢測(cè)Snai1、ERCC1、E-cadherin蛋白表達(dá)：將0.3%明膠預(yù)處理玻片置入6 孔板中，每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后取出玻片，冷丙酮固定30 min，山羊血清封閉1 h，Snai1 一抗（1∶100 稀釋?zhuān)?、ERCC1 一抗（1∶50 稀釋?zhuān)?、E-cadherin 一抗（1∶100 稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜，熒光二抗（1∶75 稀釋?zhuān)┓跤? h，DAPI（2 μg/mL）細(xì)胞核染色，l h 內(nèi)熒光顯微鏡攝影。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、SGC7901/DDP 細(xì) 胞Snai1、ERCC1、E-cadherin 蛋白表達(dá)變化

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，DDP 耐藥SGC7901/DDP 細(xì)胞中的Snai1、ERCC1 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別增高至DDP 敏感親本SGC7901 細(xì)胞的（3.702±0.126）倍、（4.489±0.140）倍，E-cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低至DDP 敏感親本SGC7901 細(xì)胞的（0.375±0.049）倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)圖1）。

二、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染amiRNA-Snai1 的SGC7901/DDP細(xì)胞Snai1、ERCC1、E-cadherin 蛋白表達(dá)變化

蛋白質(zhì)印跡法和免疫熒光法檢測(cè)顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染amiRNA-Snai1 的SGC7901/DDP-amiRNA組 細(xì)胞，Snai1、ERCC1 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的SGC7901/DDP-Mock組細(xì)胞（Snai1:0.268±0.035 對(duì)0.947±0.049,P＜0.05;ERCC1:0.211±0.012 對(duì)0.925±0.033,P＜0.05），熒光強(qiáng)度較SGC7901/DDP組細(xì)胞明顯減弱；E-cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于SGC7901/DDP-Mock組細(xì)胞（1.591±0.186對(duì)0.979±0.022,P＜0.05），熒光強(qiáng)度較SGC7901/DDP組細(xì)胞明顯增強(qiáng)（見(jiàn)圖2、圖3）。

三、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染amiRNA-Snai1 對(duì)SGC7901/DDP細(xì)胞對(duì)DDP 敏感性的影響

經(jīng)不同濃度（0.01、0.1、1.0、10.0 mg/L）DDP 作用24 h，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染amiRNA-Snai1 的SGC7901/DDPamiRNA組細(xì)胞相對(duì)存活率分別為82.43%±0.06%、55.06%±0.06%、16.59%±0.06%、6.68%±0.06%，IC50值為（0.116±0.017）mg/L；而經(jīng)上述濃度DDP 作用的轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的SGC7901/DDP-Mock組細(xì)胞，相對(duì)存活率分別為95.96%±0.05%、87.87%±0.07%、60.20%±0.08%、9.60%±0.06%，IC50值 為（2.344±0.155）mg/L。DDP 對(duì)SGC7901/DDP-amiRNA組細(xì)胞的IC50值顯著低于SGC7901/DDP-Mock組細(xì)胞（P＜0.05）（見(jiàn)圖4）。

圖4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染amiRNA-Snai1 對(duì)SGC7901/DDP 細(xì)胞對(duì)DDP 敏感性的影響

討 論

在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞可發(fā)生EMT，即上皮性腫瘤細(xì)胞失去極性，轉(zhuǎn)分化為具有運(yùn)動(dòng)能力的間質(zhì)細(xì)胞[7]。EMT 使腫瘤細(xì)胞具有間質(zhì)細(xì)胞表型，從而影響腫瘤的分化、侵襲、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為，并使腫瘤對(duì)化療產(chǎn)生抵抗[4～6]。然而，EMT 的發(fā)生涉及多個(gè)信號(hào)通路和復(fù)雜的分子機(jī)制，其引起腫瘤耐藥的確切機(jī)制尚未完全闡明[8～10]。

鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail 家族是生物體內(nèi)的一類(lèi)堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix,bHLH）轉(zhuǎn)錄因子，其家族成員，尤其是Snai1 被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT 的重要調(diào)控因子，可通過(guò)與上皮細(xì)胞黏附分子E-cadherin 啟動(dòng)子區(qū)的E-box 作用元件結(jié)合而抑制E-cadherin 基因轉(zhuǎn)錄，下調(diào)E-cadherin表達(dá)，使上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，最終引起EMT[1,2]。本研究蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，DDP 耐藥SGC7901/DDP 細(xì)胞中的Snai1 蛋白相對(duì)表達(dá)量較DDP 敏感親本SGC7901 細(xì)胞顯著增高，且有研究[11]發(fā)現(xiàn)抑制E-cadherin 可通過(guò)誘導(dǎo)EMT 增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，由此推測(cè)SGC7901/DDP 細(xì)胞中Ecadherin 蛋白呈低水平表達(dá)。本研究蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)驗(yàn)證了這一推測(cè)。

胃癌細(xì)胞株經(jīng)DDP 誘導(dǎo)建立耐藥株后，其對(duì)DDP 的耐受性增強(qiáng)與細(xì)胞對(duì)DNA 損傷的修復(fù)能力增強(qiáng)有關(guān)，ERCC1 基因在其中起關(guān)鍵作用[12]。研究[13]顯示Snai1 可直接調(diào)節(jié)ERCC1 基因轉(zhuǎn)錄，通過(guò)上調(diào)ERCC1 表達(dá)促成腫瘤對(duì)DDP 耐藥。本研究蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)證實(shí)DDP 耐藥SGC7901/DDP 細(xì)胞中的Snai1、ERCC1 蛋白相對(duì)表達(dá)量較DDP 敏感親本SGC7901 細(xì)胞顯著增高。

為進(jìn)一步明確Snai1 及其調(diào)控的信號(hào)通路在胃癌多藥耐藥中的作用，本研究以amiRNA-Snai1沉默DDP 耐藥SGC7901/DDP 細(xì)胞的Snai1 基因表 達(dá)，通過(guò)觀察SGC7901/DDP 細(xì)胞中Snai1、Ecadherin、ERCC1 蛋白表達(dá)的變化及其對(duì)DDP 敏感性的變化，探討amiRNA-Snai1 逆轉(zhuǎn)SGC7901/DDP細(xì)胞對(duì)DDP 耐藥性的作用及其可能機(jī)制。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染amiRNA-Snai1 的SGC7901/DDP 細(xì)胞Snai1、ERCC1 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，E-cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增高，免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果與蛋白質(zhì)印跡法呈相同趨勢(shì)。DDP 對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染amiRNA-Snai1 SGC7901/DDP 細(xì)胞的IC50值顯著降低，表明amiRNA-Snai1 能增加SGC7901/DDP 細(xì)胞對(duì)DDP 的敏感性。

綜上所述，以amiRNA-Snai1 沉默Snai1 基因表達(dá)可能通過(guò)下調(diào)ERCC1 表達(dá)、上調(diào)E-cadherin表達(dá)而逆轉(zhuǎn)耐藥人胃癌細(xì)胞株SGC7901/DDP 對(duì)DDP 的耐藥性。由此提示Snai1 上調(diào)ERCC1 表達(dá)、下調(diào)E-cadherin 表達(dá)是胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT、促成胃癌對(duì)DDP 耐藥的關(guān)鍵因素，這一發(fā)現(xiàn)為克服胃癌治療中的DDP 耐藥提供了新的研究思路。目前EMT 引起腫瘤耐藥的確切機(jī)制尚未完全闡明，逆轉(zhuǎn)腫瘤對(duì)DDP 耐藥的調(diào)控通路仍有待進(jìn)一步研究。

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