許春紅 郭慧敏 王 軍 李建琦 陳 敏 鄒曉平

南京醫(yī)科大學附屬鼓樓臨床醫(yī)學院消化科1（210008）南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化科2

多藥耐藥是惡性腫瘤化療失敗的主要原因。Snai1 為鋅指轉錄因子Snail 家族成員之一，研究顯示其可通過調控下游靶基因E-鈣黏蛋白（Ecadherin）等的表達介導腫瘤細胞發(fā)生上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition,EMT），促進腫瘤侵襲轉移[1～3]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)包括Snai1 及其調控的信號通路在內的EMT 相關基因與腫瘤耐藥相關，腫瘤細胞發(fā)生EMT 可促成腫瘤對化療耐藥[4～6]。本研究以人工合成microRNA（artificial microRNA,amiRNA）-Snai1 質粒轉染對順鉑（cisplatin,DDP）耐藥的人胃癌細胞株SGC7901/DDP 以沉默Snai1 基因表達，通過觀察SGC7901/DDP 細胞中Snai1、Ecadherin和耐藥基因切除修復交叉互補基因1（ERCC1）蛋白表達的變化及其對DDP 敏感性的變化，探討amiRNA-Snai1 逆轉SGC7901/DDP 細胞對DDP 耐藥性的作用及其可能機制，為進一步明確Snai1 及其調控的信號通路在胃癌多藥耐藥中的作用提供實驗依據。

材料與方法

一、腫瘤細胞株和主要試劑

人中分化胃腺癌細胞株SGC7901、SGC7901/DDP和amiRNA-Snai1 真核表達質粒為南京醫(yī)科大學附屬鼓樓臨床醫(yī)學院消化科實驗室凍存或構建；DDP（齊魯制藥有限公司）；LipofectamineTM2000轉染試劑、殺稻瘟素、熒光二抗、DAPI（invitrogenTM,Life Technologies Corporation）；兔抗人Snai1+Snai2多克隆抗體、小鼠抗人ERCC1 單克隆抗體（Abcam plc.），兔抗人E-cadherin 單克隆抗體（Cell Signaling Technology,Inc.）；CCK-8 試劑盒（日本株式會社同仁化學研究所）。

二、實驗方法

1.細胞培養(yǎng)：SGC7901、SGC7901/DDP 細胞以含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，常規(guī)消化傳代。SGC7901/DDP細胞培養(yǎng)基中含終濃度0.1 mg/L 的DDP。

2.穩(wěn)定轉染細胞株的構建和鑒定：取對數生長期SGC7901/DDP 細胞，參照LipofectamineTM2000 轉染試劑說明書將amiRNA-Snai1 真核表達質粒和陰性對照質粒分別轉染入細胞中（SGC7901/DDP-amiRNA組和SGC7901/DDP-Mock組），轉染24 h 后以殺稻瘟素（5 μg/mL）篩選，采用有限稀釋法將存活細胞接種于96 孔板培養(yǎng)15 d，獲得穩(wěn)定轉染單克隆，以含殺稻瘟素維持濃度2.5 μg/mL 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。蛋白質印跡法和免疫熒光法檢測穩(wěn)定轉染細胞株的Snai1 蛋白表達，以明確amiRNA的沉默效應。

3.CCK-8 法檢測細胞存活率：此實驗步驟設SGC7901/DDP-amiRNA、SGC7901/DDP-Mock、SGC7901/DDP 三組。將細胞懸液（1×104/mL）接種于96 孔板，200 μL/孔。細胞貼壁后，棄原培養(yǎng)基，加入含終濃度0.01、0.1、1.0、10.0 mg/L DDP的培養(yǎng)基，另設不加藥物的對照組和不接種細胞、僅加入培養(yǎng)基的調零孔，每組設3個復孔。細胞培養(yǎng)24 h后，棄含藥培養(yǎng)基，加入新鮮配制的CCK-8 溶液100 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)1 h 后終止培養(yǎng)，于酶標儀450 nm 波長處讀取各孔A 值，取3個復孔的均值。實驗重復3 次。細胞存活率=A實驗組/A對照組×100%。繪制不同藥物濃度的細胞相對存活率曲線，計算DDP 對細胞的半數抑制濃度（IC50）。

4.蛋白質印跡法檢測Snai1、ERCC1、E-cadherin 蛋白表達：細胞以PBS 漂洗，加入細胞裂解液，冰浴震蕩30 min，4 ℃12 000 r/min 離心10 min（離心半徑7.5 cm），收集上清，BCA 法測定蛋白濃度。取30 μg 總蛋白上樣，蛋白變性后電泳，轉膜，封閉。分別加入Snai1 一抗（1∶1000 稀釋）、ERCC1一抗（1∶500 稀釋）、E-cadherin 一抗（1∶1000 稀釋）4 ℃孵育過夜，洗膜后加入1∶2000 稀釋的羊抗兔IgG（檢測Snai1、E-cadherin）或羊抗鼠IgG（檢測ERCC1），室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL 試劑，暗室曝光，顯影，定影。以α-tubulin（1∶1000 稀釋）為內參照，應用Quantity One 4.4.0 凝膠圖像分析軟件分析目的蛋白相對表達量。

5.免疫熒光法檢測Snai1、ERCC1、E-cadherin蛋白表達：將0.3%明膠預處理玻片置入6 孔板中，每孔接種2×105個細胞，培養(yǎng)24 h 后取出玻片，冷丙酮固定30 min，山羊血清封閉1 h，Snai1 一抗（1∶100 稀釋）、ERCC1 一抗（1∶50 稀釋）、E-cadherin 一抗（1∶100 稀釋）4 ℃孵育過夜，熒光二抗（1∶75 稀釋）孵育1 h，DAPI（2 μg/mL）細胞核染色，l h 內熒光顯微鏡攝影。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、SGC7901/DDP 細 胞Snai1、ERCC1、E-cadherin 蛋白表達變化

蛋白質印跡法檢測顯示，DDP 耐藥SGC7901/DDP 細胞中的Snai1、ERCC1 蛋白相對表達量分別增高至DDP 敏感親本SGC7901 細胞的（3.702±0.126）倍、（4.489±0.140）倍，E-cadherin 蛋白相對表達量降低至DDP 敏感親本SGC7901 細胞的（0.375±0.049）倍，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見圖1）。

二、穩(wěn)定轉染amiRNA-Snai1 的SGC7901/DDP細胞Snai1、ERCC1、E-cadherin 蛋白表達變化

蛋白質印跡法和免疫熒光法檢測顯示，穩(wěn)定轉染amiRNA-Snai1 的SGC7901/DDP-amiRNA組 細胞，Snai1、ERCC1 蛋白相對表達量顯著低于轉染陰性對照質粒的SGC7901/DDP-Mock組細胞（Snai1:0.268±0.035 對0.947±0.049,P＜0.05;ERCC1:0.211±0.012 對0.925±0.033,P＜0.05），熒光強度較SGC7901/DDP組細胞明顯減弱；E-cadherin 蛋白相對表達量顯著高于SGC7901/DDP-Mock組細胞（1.591±0.186對0.979±0.022,P＜0.05），熒光強度較SGC7901/DDP組細胞明顯增強（見圖2、圖3）。

三、穩(wěn)定轉染amiRNA-Snai1 對SGC7901/DDP細胞對DDP 敏感性的影響

經不同濃度（0.01、0.1、1.0、10.0 mg/L）DDP 作用24 h，穩(wěn)定轉染amiRNA-Snai1 的SGC7901/DDPamiRNA組細胞相對存活率分別為82.43%±0.06%、55.06%±0.06%、16.59%±0.06%、6.68%±0.06%，IC50值為（0.116±0.017）mg/L；而經上述濃度DDP 作用的轉染陰性對照質粒的SGC7901/DDP-Mock組細胞，相對存活率分別為95.96%±0.05%、87.87%±0.07%、60.20%±0.08%、9.60%±0.06%，IC50值 為（2.344±0.155）mg/L。DDP 對SGC7901/DDP-amiRNA組細胞的IC50值顯著低于SGC7901/DDP-Mock組細胞（P＜0.05）（見圖4）。

圖4 穩(wěn)定轉染amiRNA-Snai1 對SGC7901/DDP 細胞對DDP 敏感性的影響

討 論

在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，腫瘤細胞可發(fā)生EMT，即上皮性腫瘤細胞失去極性，轉分化為具有運動能力的間質細胞[7]。EMT 使腫瘤細胞具有間質細胞表型，從而影響腫瘤的分化、侵襲、轉移等多種生物學行為，并使腫瘤對化療產生抵抗[4～6]。然而，EMT 的發(fā)生涉及多個信號通路和復雜的分子機制，其引起腫瘤耐藥的確切機制尚未完全闡明[8～10]。

鋅指轉錄因子Snail 家族是生物體內的一類堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix,bHLH）轉錄因子，其家族成員，尤其是Snai1 被認為是腫瘤細胞發(fā)生EMT 的重要調控因子，可通過與上皮細胞黏附分子E-cadherin 啟動子區(qū)的E-box 作用元件結合而抑制E-cadherin 基因轉錄，下調E-cadherin表達，使上皮細胞向間質細胞表型轉化，最終引起EMT[1,2]。本研究蛋白質印跡法檢測顯示，DDP 耐藥SGC7901/DDP 細胞中的Snai1 蛋白相對表達量較DDP 敏感親本SGC7901 細胞顯著增高，且有研究[11]發(fā)現(xiàn)抑制E-cadherin 可通過誘導EMT 增強腫瘤細胞的耐藥性，由此推測SGC7901/DDP 細胞中Ecadherin 蛋白呈低水平表達。本研究蛋白質印跡法檢測驗證了這一推測。

胃癌細胞株經DDP 誘導建立耐藥株后，其對DDP 的耐受性增強與細胞對DNA 損傷的修復能力增強有關，ERCC1 基因在其中起關鍵作用[12]。研究[13]顯示Snai1 可直接調節(jié)ERCC1 基因轉錄，通過上調ERCC1 表達促成腫瘤對DDP 耐藥。本研究蛋白質印跡法檢測證實DDP 耐藥SGC7901/DDP 細胞中的Snai1、ERCC1 蛋白相對表達量較DDP 敏感親本SGC7901 細胞顯著增高。

為進一步明確Snai1 及其調控的信號通路在胃癌多藥耐藥中的作用，本研究以amiRNA-Snai1沉默DDP 耐藥SGC7901/DDP 細胞的Snai1 基因表 達，通過觀察SGC7901/DDP 細胞中Snai1、Ecadherin、ERCC1 蛋白表達的變化及其對DDP 敏感性的變化，探討amiRNA-Snai1 逆轉SGC7901/DDP細胞對DDP 耐藥性的作用及其可能機制。蛋白質印跡法檢測顯示，穩(wěn)定轉染amiRNA-Snai1 的SGC7901/DDP 細胞Snai1、ERCC1 蛋白相對表達量顯著降低，E-cadherin 蛋白相對表達量顯著增高，免疫熒光法檢測結果與蛋白質印跡法呈相同趨勢。DDP 對穩(wěn)定轉染amiRNA-Snai1 SGC7901/DDP 細胞的IC50值顯著降低，表明amiRNA-Snai1 能增加SGC7901/DDP 細胞對DDP 的敏感性。

綜上所述，以amiRNA-Snai1 沉默Snai1 基因表達可能通過下調ERCC1 表達、上調E-cadherin表達而逆轉耐藥人胃癌細胞株SGC7901/DDP 對DDP 的耐藥性。由此提示Snai1 上調ERCC1 表達、下調E-cadherin 表達是胃癌細胞發(fā)生EMT、促成胃癌對DDP 耐藥的關鍵因素，這一發(fā)現(xiàn)為克服胃癌治療中的DDP 耐藥提供了新的研究思路。目前EMT 引起腫瘤耐藥的確切機制尚未完全闡明，逆轉腫瘤對DDP 耐藥的調控通路仍有待進一步研究。

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