王學(xué)偉 曹 勤

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院消化內(nèi)科(200062)

膽汁反流入胃甚至食管的現(xiàn)象十分常見[1～3]，可造成胃黏膜腸化生、反流性食管炎、Barrett食管甚至食管腺癌等[4～17]。但膽汁反流致胃部疾病的具體機(jī)制仍未闡明。本研究以胃癌細(xì)胞株MKN-28為研究對(duì)象，體外觀察脂溶性膽汁酸?；鞘懰徕c（taurolithocholate,TLC）和水溶性膽汁酸甘氨鵝脫氧膽酸鈉（glycochenodeoxycholate,GCDC）對(duì)其生長(zhǎng)的影響，旨在明確不同膽汁酸對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的直接作用。

材料與方法

一、細(xì)胞株、主要試劑與儀器

胃癌細(xì)胞株MKN-28購自上海市消化疾病研究所。RPMI-1640培養(yǎng)基、牛血清白蛋白購自Gibco公司；TLC、GCDC、DMSO購自Sigma公司；MTT購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。ELIZA MAT 3000全自動(dòng)比色儀購自DRG公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN-28細(xì)胞置于培養(yǎng)箱（36.5℃、含5%CO2）。細(xì)胞以1500個(gè)/孔接種于96孔板，每孔加入100 μL含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。24 h后棄培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，加入200 μL無血清培養(yǎng)基。TLC 組加入不同濃度 TLC（6 μmol/L、60 μmol/L、100 μmol/L和 300 μmol/L）， 連續(xù)培養(yǎng) 6 d；GCDC 組加入 300 μmol/L GCDC，培養(yǎng)24 h。對(duì)照組加入等體積無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間相同。

2.MTT測(cè)定：每孔加入20 μL MTT溶液，孵育2 h。棄培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO，室溫?fù)u晃5 min。 ELIZA Mat-3000全自動(dòng)比色儀于570 nm處測(cè)定吸光度A值，并于630 nm處測(cè)定吸光度A值進(jìn)行校正，以此反應(yīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SAS 6.12統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

從第 1～6 d，6 μmol/L TLC對(duì) MKN-28細(xì)胞的生長(zhǎng)無顯 著 影 響 。 干預(yù)至第 4 d 起 ，60 μmol/L、100 μmol/L 和300 μmol/L TLC均顯示對(duì)MKN-28細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用；至第5 d時(shí)，抑制作用最顯著。第6 d時(shí)，抑制作用稍減弱（見圖 1A～1C，P<0.05）。 進(jìn)一步比較 100 μmol/L 與 300 μmol/L TCL對(duì)MKN-28細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果示至干預(yù)的第5～6 d，300 μmol/L TCL組MKN-28細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制程度明顯強(qiáng)于 100 μmol/L 組（見圖 1D，P＜0.05）。 以上結(jié)果表明，TLC對(duì)MKN-28細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用與劑量相關(guān)。

300 μmol/L GCDC干預(yù)24 h，GCDC干預(yù)組的吸光度A值明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.0469±0.0059對(duì)0.0103±0.0014，P＜0.05）。 由此提示 300 μmol/L GCDC 可明顯抑制MKN-28細(xì)胞生長(zhǎng)。

討 論

以往研究發(fā)現(xiàn)，胃大部切除術(shù)易致膽汁反流入胃，是引起胃小凹上皮增生的重要原因，亦可能與殘胃癌等的發(fā)生有關(guān)。近年，隨著膽汁反流監(jiān)測(cè)技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床，研究[1～3]發(fā)現(xiàn)即使無上消化道手術(shù)史，膽汁反流入胃甚至食管的現(xiàn)象亦十分常見，并可能與胃黏膜腸化生、反流性食管炎、Barrett食管甚至食管腺癌等的發(fā)生有關(guān)[4～17]。因此，膽汁反流不僅是一種術(shù)后并發(fā)癥，且生理狀況下的過度反流，亦可能參與某些胃和食管疾病的發(fā)生和發(fā)展，因此具有潛在致病作用。Dresner等[10]的研究亦支持上述觀點(diǎn)。但目前膽汁反流致胃部疾病的具體機(jī)制尚未完全闡明，本研究觀察脂溶性TLC和水溶性GCDC對(duì)體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞株MKN-28生長(zhǎng)的影響，旨在明確膽汁反流致胃部疾病的可能機(jī)制。

脂溶性膽汁酸TLC和水溶性膽汁酸GCDC是膽汁酸家族的兩大重要成分。其中TLC的水溶性較差，在無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中的濃度＞25 μmol/L即會(huì)析出，為保持其水溶性，本研究以牛血清白蛋白按4∶1的摩爾比配置TLC溶液，按照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將TLC濃度設(shè)置為6 μmol/L、60 μmol/L、100 μmol/L 和 300 μmol/L。 GCDC 的水溶性較好，可直接溶于RPMI-1640無血清培養(yǎng)基。本課題組的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，100 μmol/L 和 200 μmol/L GCDC 對(duì) MKN-28 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響均不顯著，遂將GCDC劑量增至300 μmol/L，結(jié)果示干預(yù)24 h即可明顯抑制MKN-28細(xì)胞生長(zhǎng)。

MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞死亡率的原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可將外源性MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶并沉積于細(xì)胞內(nèi)，DMSO可溶解此結(jié)晶，通過酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定吸光度A值，可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。因此本研究采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞死亡，結(jié)果示60 μmol/L、100 μmol/L和300 μmol/L TLC干預(yù)至第4 d起，可明顯抑制MKN-28細(xì)胞生長(zhǎng)。至第5 d時(shí)，抑制作用最顯著；第6 d時(shí)，抑制作用稍減弱；300 μmol/L TCL干預(yù)第5～6 d時(shí)，對(duì)MKN-28細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用明顯強(qiáng)于100 μmol/L。GCDC 300 μmol/L干預(yù)24 h亦可顯著抑制MKN-28細(xì)胞生長(zhǎng)。由此提示無論是脂溶性還是水溶性膽汁酸，均可在體外直接抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

近年研究發(fā)現(xiàn)，膽汁酸可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。GCDC誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的過程中，F(xiàn)as（CD95）可發(fā)生不依賴配體的寡聚化激活，通過結(jié)合Fas相關(guān)死亡功能體激活凋亡蛋白酶8，激活一系列下游凋亡蛋白酶，包括組織蛋白酶B，使其從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核并發(fā)揮蛋白水解酶活性，從而參與細(xì)胞的凋亡[18,19]。推測(cè)本研究中GCDC抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)與其通過CD95途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡有關(guān)，但還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

?；鞘懰?3-硫酸（TLCS）是TLC的脂溶性硫酸化產(chǎn)物[20]，可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與活性氧產(chǎn)物激活Src激酶家族成員Yes，后者進(jìn)一步激活JNK和PKC并活化CD95，由此誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[20～22]。上述研究提示TLC可能通過Yes-JNK/PKC-CD95途徑促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。

體內(nèi)研究[10]提示長(zhǎng)期膽汁反流可致胃小凹上皮增生和反流性食管炎鱗狀上皮增生，并可能與腸化生甚至癌變有關(guān)。與此處TLC和GCDC抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的作用不符，由此提示長(zhǎng)期膽汁反流可能存在間接作用機(jī)制，通過克服膽汁酸對(duì)胃上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的直接抑制作用而促進(jìn)其增生，但目前其中的機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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