郭翀，李白霞，張真銘，王玉明

時間分辨熒光免疫分析法檢測游離F-βHCG的方法學(xué)評價(jià)

郭翀，李白霞，張真銘，王玉明

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明650032）

目的對時間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）定量檢測F-βHCG的各種性能指標(biāo)進(jìn)行方法學(xué)評價(jià),驗(yàn)證其臨床適用性。方法通過靈敏度、批內(nèi)和批間精密度、標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性參數(shù)等指標(biāo)評價(jià)TRFIA檢測F-βHCG的性能，同時通過回收試驗(yàn)分析其準(zhǔn)確度。結(jié)果F-βHCG的最小測定值為0.09ng/ml，低、中、高3種質(zhì)控品批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%，標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性參數(shù)各變異系數(shù)小于5%，回收試驗(yàn)結(jié)果在97%～104.7%之間。結(jié)論TRFIA法檢測F-βHCG具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、能自動化分析等優(yōu)點(diǎn)，能充分滿足臨床檢測的需求。

時間分辨；免疫分析；F-βHCG；方法學(xué)評價(jià)

隨著生物標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫分析技術(shù)有了長足的進(jìn)步。表現(xiàn)為免疫分析技術(shù)逐步由放射免疫分析技術(shù)向非放射免疫技術(shù)轉(zhuǎn)變。在此期間，涌現(xiàn)了一大批非放射免疫技術(shù)，時間分辨熒光免疫分析技術(shù)(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)正是這類非放射免疫技術(shù)的一個典型代表[1]。

HCG是由合體滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的水溶性糖蛋白激素，其分子的a、β鏈（亞單位）通過電荷和離子鍵的相互作用結(jié)合在一起。由于兩個亞基有多個低聚糖分子側(cè)鏈，構(gòu)成了HCG分子結(jié)構(gòu)的不均性，因此人血液中HCG有多種變異體：整分子HCG、多糖基化HCG、缺口HCG、丟失β亞基c端肽HCG、游離a亞基和游離β亞基HCG（F-βHCG）等[2]。妊娠早期，HCG的濃度迅速增高，監(jiān)測尿中的HCG即可證實(shí)妊娠[3]。另外，HCG的含量與許多異位HCG表達(dá)的腫瘤有密切關(guān)系，可將HCG看作是相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物之一[4]，因此，HCG的檢查不僅對早孕檢測具有重要意義，而且可對滋養(yǎng)層細(xì)胞腫瘤和非滋養(yǎng)層細(xì)胞腫瘤的診斷與鑒定診斷提供依據(jù)。并且，F(xiàn)-βHCG作為唐氏綜合征篩查項(xiàng)目之一，要求其檢測方法具有較高的準(zhǔn)確性、靈敏度和特異性。本研究對TRFIA法檢測F-βHCG的精密度、靈敏度、特異性、回收率等性能指標(biāo)進(jìn)行了評估，以期進(jìn)一步驗(yàn)證TRFIA法檢測F-βHCG的臨床適用性。

材料和方法

一、材料

1．儀器和試劑：時間分辨熒光免疫分析儀（1235 AutoDelfia，PerkinElmer），F(xiàn)-βHCG試劑盒（PerkinElmer），F(xiàn)-βHCG試劑盒。

2．質(zhì)控標(biāo)本blank“O”為男性血清。質(zhì)控品為所收集的病人血清混合制成，分為低、中、高3種水平，以化學(xué)發(fā)光法測得β-HCG的值為依據(jù)，分類如下：低值質(zhì)控（β-HCG值﹤10.0U/L）、中值質(zhì)控（β-HCG值1 000.0～3 000.0 U/L）、高值質(zhì)控（β-HCG值﹥10 000.0 U/L）。質(zhì)控血清經(jīng)少量分裝，-20℃冷凍保存。標(biāo)準(zhǔn)品由F-βHCG檢測試劑盒提供。

3．研究對象150例孕婦血清標(biāo)本。

二、方法

1．標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別測定六個標(biāo)準(zhǔn)品濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線采用平滑樣條曲線（SPLINE SMOOTHED）函數(shù)擬合，X-AXIS：LOG，Y-AXIS:LOG-B

2．靈敏度：用blank“O”血清對β-HCG標(biāo)準(zhǔn)品（2.4ng/ml)進(jìn)行稀釋，稀釋梯度為1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128，制成7個待測樣品進(jìn)行F-βHCG實(shí)驗(yàn)。

3．精密度：用低、中、高值3種質(zhì)控血清分別進(jìn)行批內(nèi)和批間精密度實(shí)驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)為20次，并對測定結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（slope）、有效劑量值（effective dose,ED）20、ED50、ED80等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

4．準(zhǔn)確性：在濃度為20.83ug/L的血清內(nèi)分別加入低、中、高值的標(biāo)準(zhǔn)品，制成3個待測樣品，進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)。

5．特異性（交叉試驗(yàn)）：將AFP、CEA配成500ug/L的濃度，用F-βHCG試劑盒進(jìn)行測定，了解與F-βHCG有無交叉反應(yīng)。

6．線性范圍：一高值血清，用blank 0按 1/10的比例稀釋，各測定3次，以原倍血清測定值為標(biāo)準(zhǔn)按稀釋倍數(shù)算得其理論值，與實(shí)際測定值比較進(jìn)行線性分析。

7．相關(guān)性實(shí)驗(yàn)：分別用本法和PerkinElmer Wallac公司生產(chǎn)的試劑盒同時測定50例高、中、低值的樣本，進(jìn)行線性回歸分析。

8．統(tǒng)計(jì)分析：應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析，α＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

二、靈敏度結(jié)果如表1所示。

F-βHCG試劑盒使用說明書提示F-βHCG的最低檢測限應(yīng)不大于0.2ng/ml，結(jié)合說明書上靈敏度的變異系數(shù)應(yīng)小于15.0%，所以本實(shí)驗(yàn)室檢測條件下該試劑盒檢測F-βHCG的最小測定值為0.09ng/ml。這與相關(guān)類似報(bào)道結(jié)果相符合[1]。

三、精密度結(jié)果精密度測試結(jié)果見表2，標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性測試結(jié)果見表3。

本研究結(jié)果表明，低、中、高3種質(zhì)控樣品批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%，標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性各參數(shù)(slope、ED20、ED50、ED80)變異系數(shù)也均小于5%，提示系統(tǒng)精度和穩(wěn)定性均較高。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 F-βHCG靈敏度測試結(jié)果（n=20)

表2 精密度測試結(jié)果（n=20）

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性度測試結(jié)果（n=20）

四、準(zhǔn)確度測試結(jié)果回收實(shí)驗(yàn)測試系統(tǒng)準(zhǔn)確度的結(jié)果如表4。

五、特異性試驗(yàn)當(dāng)AFP、CEA在500μg/L濃度條件下，F(xiàn)-βHCG的檢測結(jié)果均小于0.09ng/ml。

六、線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

當(dāng)濃度上限為320ng/ml時回歸方程為：Y＝0.967X+1.482，r＝0.999；濃度上限為360ng/ml時回歸方程為：Y＝1.023X-5.381，r＝0.994；濃度上限為400ng/ml時回歸方程為：Y＝1.106X-13.758，r＝0.968。說明本法在320ng/ml范圍以內(nèi)內(nèi)線性良好。

七、相關(guān)性分析相關(guān)性分析見圖2。

回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明系統(tǒng)測試準(zhǔn)確度較高。用上述兩種方法對150份受檢血清進(jìn)行F-βHCG定量分析，測定結(jié)果作相關(guān)性分析，結(jié)果表明，兩種方法差異無顯著性（P＞0.05），直線回歸方程為：Y（鉑金埃爾默）＝0.982X（新波）+0.349，r＝0.988，兩法呈正相關(guān)。

討論

目前隨著先進(jìn)技術(shù)的迅猛發(fā)展，各種診斷試驗(yàn)（包括診斷設(shè)備、試劑、方法等）層出不窮，臨床實(shí)驗(yàn)室開展的檢驗(yàn)項(xiàng)目也越來越多。并形成各種組合，但并不是每一種診斷試驗(yàn)肯定比常規(guī)或舊試驗(yàn)好。有時同一檢驗(yàn)項(xiàng)目有不同的檢測系統(tǒng)，但不同檢測系統(tǒng)測定檢驗(yàn)項(xiàng)目時的分析性能和檢驗(yàn)項(xiàng)目在臨床診療過程中的作用在檢驗(yàn)文獻(xiàn)中探討不深入。有的甚至很模糊。廠商為了銷售也是夸大其詞，再加管理上的欠缺，導(dǎo)致了檢驗(yàn)項(xiàng)目的濫用，浪費(fèi)了很多的人力和物力，也影響了檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)在臨床醫(yī)學(xué)中的地位。

時間分辨熒光免疫分析技術(shù)是一種利用稀土離子及其螯合物作為示蹤劑的靈敏度高、線性范圍寬、應(yīng)用范圍廣的非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)。為了進(jìn)一步將這一先進(jìn)超微量物質(zhì)檢驗(yàn)技術(shù)推廣于臨床應(yīng)用，根據(jù)美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）制訂的臨床評價(jià)方案，對國產(chǎn)的時間分辨熒光免疫法檢測F-βHCG試劑盒制訂了臨床實(shí)驗(yàn)方法和評價(jià)方案。結(jié)果表明該試劑可操作性強(qiáng)，結(jié)果可信,經(jīng)濟(jì)適用，可作為同類檢驗(yàn)儀器和方法學(xué)進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)的參考。

時間分辨熒光免疫分析技術(shù)，具有靈敏度高，重復(fù)性好，標(biāo)準(zhǔn)曲線動態(tài)范圍寬，標(biāo)記物存儲時間長等優(yōu)點(diǎn)[5]，同時由于時間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)采用波長分辨和時間分辨等方法，提高了系統(tǒng)的探測靈敏度和探測特異性，真正實(shí)現(xiàn)了近似零本底測量，從而大大減少了檢測系統(tǒng)的系統(tǒng)誤差，有效地提高了探測精度。時間分辯熒光免疫分析法檢測F-βHCG具有本底低，特異性強(qiáng)，標(biāo)記物存放時間長，可重復(fù)多次檢測，重復(fù)性好，標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性高，可全自動化操作等優(yōu)點(diǎn)。其靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度等性能指標(biāo)，均符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，而且我們采用的β-HCG-TRFIA分析系統(tǒng)由于其高度自動化，能有效提高臨床大樣本量檢驗(yàn)結(jié)果的速度，大幅度降低人為誤差，增加檢出結(jié)果的可靠性，對整個妊娠過程的臨床診斷、治療及預(yù)后評判起到更好的指導(dǎo)作用。因此時間分辨熒光免疫分析法是定量檢測β-HCG的優(yōu)秀方法。

表4 準(zhǔn)確度測試（回收試驗(yàn)）結(jié)果

表5 線性實(shí)驗(yàn)

［1］秦衛(wèi)仕,田蓉.時間分辨熒光免疫分析方法學(xué)評價(jià)[J]．免疫學(xué)雜志,2002,18（5）：397-399.

［2］黃樹峰.人絨毛膜促性腺激素測定在婦產(chǎn)科中的應(yīng)用[J]．中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志,2006,2（3）：172-174.

［3］楊廷富.人絨毛膜促性腺激素的臨床意義及檢測進(jìn)展[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2007,10（4）：976-978.

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Evaluation of the methodology of the time-resolved fluoroimmunoassay in F-βHCG measurements.

GUO Chong,LI Bai-xia,ZHANG Zhen-ming,et al.
(Department of Clinical Laboratory,The First Affiliated Hospital of KunmingMedical College,Yunnan,Kunming650032,China)

ObjectiveThe methodology of time-resolved fluoroimmunoassay(TRFIA)that detected F-βHCG was evaluated by quantitative assay.MethodsThe functional sensitivity of free β-HCG,imprecision of extra-assay and intra-assaywere tested with free β-HCG assay.The recoverytests were performed byquantitative assay with free β-HCG assay.ResultsThe functional sensitivity of the free β-HCG assay was 0.09ng/ml.The extra-assay cv% and the intra-assay cv%were smaller than 10%,and approved that the stability parameter various coefficient of variation was also smaller than 5%.The recycling experiment result was 97%～104.7%.ConclusionIt is concluded that the methodology of time-resolved fluoroimmunoassay offers many benefits in sensitivity,precision,accuracy, reliabilityand practicability.

Time-resolved；Immunoassay；F-βHCG；Methodology

R446.6

A

1006-4141（2012）04-0352-04

2012－06－08

郭翀（1977～）男，1997年畢業(yè)于昆明醫(yī)學(xué)院，主管檢驗(yàn)師。