陸小元

(江蘇省姜堰市中醫(yī)院藥劑科,江蘇姜堰,225400)

近年來(lái),氧化應(yīng)激與糖尿病腎病(DN)的關(guān)系日益受到關(guān)注[1]。研究[2]表明,氧化損傷在DN病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶是產(chǎn)生活性氧簇(ROS)的重要來(lái)源,可以NADPH作為電子供體,將氧催化為O2-[3]。麥冬具有生津養(yǎng)陰、清熱潤(rùn)燥、除煩消渴的功效,而麥冬多糖為麥冬的主要成分之一,近年來(lái),研究[4-5]表明其具有抗炎、抗心肌缺血、降血糖、耐缺氧、抗過(guò)敏等作用。最新研究[6]表明,麥冬多糖還具有抗氧化作用。本研究觀察麥冬多糖對(duì)糖尿病大鼠腎臟NADPH氧化酶亞單位p47phox和核因子-κB(NF-κB)表達(dá)的影響 ,探討其對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SD大鼠,體質(zhì)量180～220 g(南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司);麥冬多糖(西安金綠生物工程技術(shù)有限公司);肌酐、尿素氮檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所);總抗氧化能力、過(guò)氧化氫檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所);小鼠抗大鼠p47phox單克隆抗體、小鼠抗大鼠NF-κB單克隆抗體、小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體及山羊抗鼠辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2 糖尿病大鼠模型復(fù)制及分組

健康雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機(jī)分為對(duì)照組與糖尿病組。對(duì)照組喂以普通飼料,糖尿病組則喂以高脂飼料(高脂飼料由78.5%普通飼料、10%蛋黃粉、10%豬油、1%膽固醇和膽鹽0.5%混合而成)。飼養(yǎng)4周后禁食12 h,模型組大鼠一次性腹腔注射35 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)溶液(pH4.5的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液冰浴中新鮮配制),對(duì)照組大鼠則腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。72h后檢測(cè)血糖,凡連續(xù)5 d測(cè)得隨機(jī)血糖≥13 mmol/L者初步確認(rèn)糖尿病模型成立,血糖不符合要求者則剔除。選造模成功的糖尿病大鼠隨機(jī)分為模型組、麥冬多糖(200、400、800 mg/kg)劑量組 。另設(shè)對(duì)照組 ,每組8只。灌胃給藥,連續(xù)給藥6周。對(duì)照組和模型組給予等體積蒸餾水。

1.3 空腹血糖(FBG)測(cè)定

給藥前及給藥期間每2周測(cè)定1次FBG,采血當(dāng)天各組大鼠禁食(不禁水)12 h,以采血針刺破大鼠尾尖,毛細(xì)血管采血,按說(shuō)明書(shū)用血糖儀和血糖試紙測(cè)定大鼠FBG。

1.4 標(biāo)本采集

給藥6周后用2%戊巴比妥鈉60 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。頸動(dòng)脈采血,用于血肌酐、尿素氮的測(cè)定。游離左、右腎組織,精確稱重,分別計(jì)算左、右腎臟指數(shù)(腎臟指數(shù)=腎重量/體質(zhì)量)。左、右腎組織-80℃冰箱保存用于相應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.5 血清肌酐、尿素氮測(cè)定

頸動(dòng)脈采血4mL,以3500 r/min、4℃離心20 min,收集血清,按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)的含量。

1.6 腎組織總抗氧化能力(T-AOC)及過(guò)氧化氫(H2O2)堅(jiān)持測(cè)

準(zhǔn)確稱取100 mg腎組織(左、右腎各50 mg)加入1 mL預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液中,制備10%的組織勻漿。12000 r/min、4℃離心5 min,按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定腎組織中T-AOC、H2O2的含量;二辛可酸(BCA)法測(cè)定腎組織蛋白濃度。

1.7 Western blot檢測(cè)腎 p47phox、NF-κB 蛋白表達(dá)

低溫提取組織或細(xì)胞蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。每孔上樣50 μg蛋白,12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離樣品,轉(zhuǎn)膜 ,封閉 ,分別加入p47phox(1∶500)、NF-κB(1∶1000)和 β-actin(1∶2000)一抗,4 ℃過(guò)夜。洗膜,加入二抗(1∶2000)室溫孵育1 h。洗膜后將高靈敏的LunimataTMCrescendo發(fā)光劑加到膜的正面,采用Bio-Rad ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。圖像用Image J 1.43(National Institutes of Health)軟件進(jìn)行灰度值分析,以β-actin為內(nèi)參蛋白,計(jì)算蛋白表達(dá)水平相對(duì)值。計(jì)算方法:蛋白表達(dá)相對(duì)值=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)FBG的影響

給藥前與對(duì)照組比較,模型組、麥冬多糖(200、400、800mg/kg)組FBG均顯著升高(P<0.01),說(shuō)明模型成功。給藥后與模型組比較,麥冬多糖800 mg/kg組給藥2周后,以及麥冬多糖400mg/kg組給藥4周后,FBG均明顯降低(P<0.05或 P<0.01);麥冬多糖 200 mg/kg組大鼠FBG也降低,但未出現(xiàn)顯著差異。以上結(jié)果表明麥冬多糖可降低2型糖尿病大鼠FBG。見(jiàn)表1。

表1 各組FBG水平變化(,n=8)

表1 各組FBG水平變化(,n=8)

與對(duì)照組比較,＊＊P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。

組別 給藥前 給藥2周 給藥4周 給藥6周對(duì)照組 5.68±0.61 5.34±0.38 6.01±0.42 5.93±0.51模型組 19.88±2.72＊＊ 19.86±3.31＊＊ 20.96±2.79＊＊ 19.69±4.41＊＊麥冬多糖200 mg/kg組 20.81±3.54 16.89±5.36 14.35±4.25 15.48±3.29麥冬多糖400 mg/kg組 20.26±2.66 15.57±4.34 13.73±3.28# 13.01±2.34##麥冬多糖800 mg/kg組 19.55±2.85 13.32±2.89# 12.02±2.48## 12.45±2.39##

2.2 對(duì)腎臟指數(shù)的影響

與對(duì)照組比較,模型組大鼠左、右腎臟指數(shù)均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,麥冬多糖各劑量組大鼠左、右腎臟指數(shù)均顯著降低(P<0.05或 P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組腎臟指數(shù)、Scr及BUN水平變化(,n=8)

表2 各組腎臟指數(shù)、Scr及BUN水平變化(,n=8)

與對(duì)照組比較,＊＊P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。

組別 左腎指數(shù)/mg·g-1 右腎指數(shù)/mg·g-1 Scr/μ mol·L-1 BUN/mmol·L-1對(duì)照組 2.89±0.25 3.05±0.29 42.59±4.85 4.57±0.75模型組 8.87±0.71＊＊ 9.11±0.87＊＊ 79.58±8.79＊＊ 13.33±2.47＊＊麥冬多糖200 mg/kg組 5.66±0.58# 6.22±0.63# 64.69±9.22# 10.91±1.33#麥冬多糖400 mg/kg組 4.96±0.41## 5.53±0.57## 56.01±5.78## 9.84±1.02##麥冬多糖800 mg/kg組 4.45±0.39## 5.31±0.49## 54.18±5.48## 9.44±0.95##

2.3 對(duì)Scr及BUN的影響

與對(duì)照組比較,模型組大鼠Scr、BUN水平均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,麥冬多糖各劑量組大鼠Scr、BUN均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.4 對(duì)腎臟p47phox、NF-κB蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較,模型組大鼠腎臟p47phox、NF-κB蛋白均顯著升高(P<0.01)。與模型組組比較,麥冬多糖各劑量組大鼠腎臟 p47phox、NF-κB蛋白均顯著降低(P<0.05或 P<0.01)。見(jiàn)圖1、表 3。

圖1 麥冬多糖對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟p47phox、NF-κB蛋白表達(dá)的影響

表3 各組腎臟p47phox、NF-κB蛋白表達(dá)以及T-AOC、含量H2O2變化(,n=8)

表3 各組腎臟p47phox、NF-κB蛋白表達(dá)以及T-AOC、含量H2O2變化(,n=8)

與對(duì)照組比較,＊＊P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。

組別 p47phox蛋白水平 NF-κB蛋白水平 T-AOC/mmol·g-1 H2O2/μ mol·L-1對(duì)照組 1.03±0.11 1.12±0.14 3.97±0.37 457.43±51.46模型組 3.98±0.42＊＊ 3.21±0.35＊＊ 2.08±0.31＊＊ 649.79±60.85＊＊麥冬多糖200 mg/kg組 2.85±0.29# 2.55±0.23# 2.67±0.35# 584.61±59.85#麥冬多糖400 mg/kg組 2.51±0.26## 2.37±0.29## 2.93±0.26## 554.76±63.63##麥冬多糖800 mg/kg組 2.38±0.23## 2.13±0.22## 2.94±0.34## 510.83±47.26##

2.5 對(duì)腎臟T-AOC、H2O2含量的影響

與對(duì)照組比較,模型組大鼠腎臟T-AOC及H2O2含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,麥冬多糖各劑量組大鼠腎臟T-AOC及H2O2含量顯著降低(P<0.05或 P<0.01)。見(jiàn)表3。

3 討 論

DN是糖尿病患者最主要的微血管病變之一,早期病理改變?yōu)槟I小球肥大、基底膜增厚及細(xì)胞外基質(zhì)的積聚,晚期則表現(xiàn)為腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化,一旦發(fā)展到終末階段,其療效及預(yù)后均較差。本研究結(jié)果顯示,麥冬多糖可明顯降低糖尿病大鼠FBG,與文獻(xiàn)[7]報(bào)道一致。同時(shí),本研究還發(fā)現(xiàn),隨著病程進(jìn)展,糖尿病組大鼠Scr、BUN及腎臟指數(shù)明顯升高,而麥冬多糖組Scr、BUN水平及腎臟指數(shù)明顯下降,表明麥冬多糖對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟具有保護(hù)作用。

近年來(lái),DN被視為是一種由氧化應(yīng)激引起的炎癥性疾病[8]。糖尿病大鼠腎臟組織內(nèi)的氧化應(yīng)激水平顯著升高,細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的高水平活性氧(ROS)可以通過(guò)增強(qiáng)對(duì)NF-κB的抑制蛋白ⅠκB的解離,激活 NF-κB與 DNA 的結(jié)合活性,進(jìn)一步激活NF-κB相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[9]?；罨腘F-κB可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并與含有基因轉(zhuǎn)錄序列的DNA結(jié)合,促進(jìn)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子、炎癥介質(zhì)、黏附分子等相關(guān)基因表達(dá),造成細(xì)胞外基質(zhì)合成增多,降解減少,促進(jìn)細(xì)胞間質(zhì)纖維化[10]。本研究結(jié)果顯示,糖尿病大鼠腎臟組織中的H2O2水平、NF-κB表達(dá)均高于正常大鼠,而腎臟總抗氧化能力明顯降低,而麥冬多糖能明顯提高腎臟的總抗氧化能力、降低H2O2水平及NF-κB的表達(dá)。

已有研究[11]表明,NADPH氧化酶的過(guò)度活化是細(xì)胞內(nèi)高水平ROS產(chǎn)生的重要來(lái)源,p47phox是NADPH氧化酶發(fā)揮活性的關(guān)鍵亞基,具有影響NADPH氧化酶介導(dǎo)ROS產(chǎn)生的作用,并且還可促進(jìn)NADPH氧化酶與NF-κB的緊密連接,直接激活NF-κB[12],因此,抑制 p47phox活性可有效的降低ROS的產(chǎn)生及NF-κB的活性,減輕糖尿病腎臟病變。本研究表明,麥冬多糖能下調(diào)糖尿病大鼠腎臟中p47phox活的表達(dá),抑制NADPH氧化酶的活性,減少ROS產(chǎn)生,降低 NF-κB的活化減輕了糖尿病腎臟病變,為臨床應(yīng)用麥冬多糖防治糖尿病腎病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述,糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激水平升高并伴隨著腎功能的降低。麥冬多糖能抑制抑制糖尿病大鼠腎組織中 p47phox、NF-κB蛋白的表達(dá),進(jìn)一步改善氧化應(yīng)激反應(yīng),延緩大鼠DN的發(fā)展,但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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