胡玉龍,李寧川,李 奇,陳曉燕,李 鈴

(揚(yáng)州大學(xué)體育學(xué)院,江蘇揚(yáng)州,225009)

隨著人們生活方式的改變,因肥胖而引起的男性生殖功能低下的發(fā)生率正逐年增加,但肥胖引起生殖功能低下的具體機(jī)制尚未清楚[1]。因中藥組方可抑制外源性脂類的吸收,抑制膽固醇、甘油三酯的合成,促進(jìn)脂類排泄,進(jìn)而能降低脂肪沉積、調(diào)節(jié)脂代謝[2];而有氧運(yùn)動(dòng)增加能耗同樣可降低脂肪在體內(nèi)沉積。本研究以補(bǔ)充中藥和有氧運(yùn)動(dòng)降低高脂膳食大鼠脂肪沉積為模型,探討高脂膳食對(duì)雄性大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)影響以及運(yùn)動(dòng)、中藥對(duì)其保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 資料

5周齡雄性SD大鼠60只(南京青山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供),體質(zhì)量140～160 g,隨機(jī)分為對(duì)照組(C組10只):飼喂普通飼料;高脂膳食組(HF組12只):飼喂高脂飼料;高脂飼料+運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(HE組13只):飼喂高脂飼料,并進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng);高脂飼料+中藥組(HZ組12只):飼喂高脂飼料,并補(bǔ)充中藥;高脂飼料+中藥+運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(HZE組13只):飼喂高脂飼料。大鼠分籠飼養(yǎng),每籠 3～5只,自由飼水,進(jìn)食,環(huán)境溫度為20～23℃。

高脂飼料配方的組成:80%的基礎(chǔ)飼料、14%的豬油、2%的膽固醇、0.5%的膽鹽、3%的麻油,由南通立默生物科技有限公司加工。中藥配方為:制何首烏、山楂 、白術(shù) 、澤瀉 、柴胡 、水蛭(炒)、冬瓜皮、荷葉、決明子、生大黃、黃芪、三七等。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)施方案:在每次訓(xùn)練前,對(duì)HZ組和HZE組大鼠以1 mL/100 g(濃度為0.8 g/mL)劑量的中藥灌胃,6次/周,補(bǔ)充10周,其余各組在10周實(shí)驗(yàn)期間灌服等量的生理鹽水。

運(yùn)動(dòng)組大鼠每次進(jìn)行60 min的無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng),6 d/周。第1天運(yùn)動(dòng)時(shí)間為15 min,每天遞增10～20min,經(jīng)1周適應(yīng)訓(xùn)練后增加至60 min,以后各周維持此運(yùn)動(dòng)量,共持續(xù)10周。1.2.2 取材:為了避免急性運(yùn)動(dòng)的影響,運(yùn)動(dòng)組大鼠于末次游泳結(jié)束次日取材;各組大鼠禁食12 h,然后稱重,依次按50 mg/kg的劑量腹腔注射2%的戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血4 mL,制備血清保存于-20℃冰箱,以備測(cè)血清指標(biāo)。

取睪周和腎周脂肪墊稱重;完整剪下大鼠睪丸、附睪,用濾紙擦拭血污后稱濕重,取一側(cè)睪丸切一塊 0.5 cm見(jiàn)方組織,放于提前準(zhǔn)備好的10%甲醛溶液中固定;再切取0.5 g睪丸組織加入預(yù)冷生理鹽水,制備10%組織勻漿液,上清液-20℃保存,以備測(cè)睪丸組織指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 睪丸組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)測(cè)定:取甲醛固定睪丸組織按常規(guī)方法制作石蠟切片,HE染色后光鏡下觀察組織切片。

1.3.2 生化指標(biāo)測(cè)定:采用貝克曼DXC-800全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中甘油三酯(TG)、膽固醇(TC);超氧化物岐化酶(SOD)水平采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè);丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)(試劑盒均購(gòu)于南京建成生物研究所),睪丸組織蛋白采用考馬氏亮藍(lán)法測(cè)定。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量 。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量、腎周和睪丸周脂肪重、睪丸和附睪重

與C組相比,大鼠喂養(yǎng)高脂飼料后,體質(zhì)量略有下降,差異無(wú)顯著性,但HF組大鼠腎周和睪丸周脂肪明顯上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與HF組相比,長(zhǎng)期的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和補(bǔ)充中藥使大鼠體質(zhì)量、腎周和睪丸周脂肪質(zhì)量都有所下降,而HZ組大鼠體質(zhì)量明顯下降(P<0.05),HE、HZ、HZE 組腎周、睪周脂肪質(zhì)量顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);各組大鼠睪丸和附睪質(zhì)量無(wú)明顯差異。見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量、腎周和睪周脂肪質(zhì)量、睪丸和附睪質(zhì)量(,g)

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量、腎周和睪周脂肪質(zhì)量、睪丸和附睪質(zhì)量(,g)

與C組比較,＊P<0.05;與HF組比較,#P<0.05,##P<0.01。

組別 例數(shù) 體質(zhì)量 腎周脂質(zhì)量 睪周脂質(zhì)量 睪丸質(zhì)量 附睪質(zhì)量C 10 588.45±42.86 2.62±0.82 1.35±0.22 1.58±0.20 0.31±0.06 HF 12 576.61±57.77 4.62±1.42＊ 2.52±0.83＊ 1.51±0.22 0.30±0.04 HE 13 557.10±46.60 2.38±0.76## 1.39±0.23## 1.48±0.10 0.32±0.03 HZ 12 534.24±33.49# 2.62±0.77## 1.58±0.31## 1.56±0.08 0.31±0.05 HZE 13 540.15±44.50 2.43±0.49## 1.62±0.25## 1.56±0.13 0.30±0.04

2.2 實(shí)驗(yàn)大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)變化

C組大鼠可見(jiàn)生精小管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞發(fā)育正常,排列整齊,管腔可見(jiàn)大量成熟精子,生精小管間可見(jiàn)疏松的間質(zhì)組織(圖1)。HF組的睪丸組織出現(xiàn)病理性改變,生精小管管壁變薄,各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)量減少,排列紊亂,成熟精子數(shù)量明顯減少,偶可見(jiàn)細(xì)胞脫落現(xiàn)象,個(gè)別大鼠生精細(xì)胞與基底膜之間出現(xiàn)脫離,生精細(xì)胞成團(tuán)脫落于管腔中(圖2)。HE、HZ、HZE組可見(jiàn)生精小管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞基本發(fā)育正常,排列整齊,管腔可見(jiàn)大量成熟精子,生精小管間可見(jiàn)疏松的間質(zhì)組織;HE組偶可見(jiàn)細(xì)胞脫落現(xiàn)象;HZ組個(gè)別大鼠生精細(xì)胞與基底膜之間出現(xiàn)脫離(圖3-5)。

圖1 C組大鼠睪丸組織(HE染色 100倍)

圖2 HF組大鼠睪丸組織(HE染色 100倍)

圖3 HE組大鼠睪丸組織(HE染色 100倍)

圖4 HZ組大鼠睪丸組織(HE染色 100倍)

圖5 HZE組大鼠睪丸組織(HE染色 100倍)

2.3 實(shí)驗(yàn)大鼠血清SOD、MDA、TNF-α、TG 、TC水平

與C組相比,HF組大鼠血清中MDA(P<0.01)、TNF-α(P<0.05)水平明顯升高,SOD明顯降低(P<0.05);與HF組相比,HE組和HZE組大鼠血清SOD顯著升高(P<0.01),HZ組大鼠血清SOD明顯升高(P<0.05),HE組和HZ組大鼠血清MDA、HZ組TNF-α顯著降低(P<0.01),而HZE組大鼠血清MDA、HE組和HZE組大鼠血清TNF-α明顯降低(P<0.05)。

與C組相比,高脂飲食使得HF組大鼠血清TG、TC水平明顯增高(P<0.01);有氧運(yùn)動(dòng)或消脂散均能顯著地降低高脂飲食大鼠血清TG、TC的水平(P<0.01),而有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合消脂散對(duì)降低高脂飲食大鼠血清TG、TC水平也有顯著作用,且數(shù)值更低(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清SOD、MDA、TNF-α、TC、TG水平()

表2 各組大鼠血清SOD、MDA、TNF-α、TC、TG水平()

與C組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01;與HF組比較,#P<0.05,##P<0.01。

組別 例數(shù) SOD/NU·mL-1 MDA/nmol·mL-1 TNF-α/ng·mL-1 TC/mmol·L-1 TG/mmol·L-1 C 10 159.56±15.80 3.96±1.50 171.03±16.74 1.14±0.19 0.88±0.23 HF 12 125.49±38.90＊ 6.23±2.45＊＊ 193.27±12.18＊ 1.80±0.17＊＊ 1.33±0.17＊HE 13 174.37±13.77## 3.25±1.29## 159.20±17.50# 1.07±0.32# 0.86±0.20#HZ 12 152.26±29.03# 4.05±0.94## 147.18±19.83## 1.02±0.28## 0.81±0.21##HZE 13 168.24±23.84## 4.37±1.24# 149.79±15.98# 1.00±0.24## 0.74±0.29##

2.4 實(shí)驗(yàn)大鼠睪丸組織SOD、MDA、TNF-α水平

與C組比較,HF組大鼠睪丸組織SOD明顯下降(P<0.05)、MDA 顯著升高(P<0.01)、TNF-α明顯升高(P<0.05);與HF組相比,游泳運(yùn)動(dòng)或補(bǔ)充消脂散可使大鼠睪丸組織SOD顯著升高(P<0.01)、MDA 顯著下降(P<0.01)、TNF-α明顯下降(P<0.05),有氧運(yùn)動(dòng)與消脂散無(wú)疊加效應(yīng)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠睪丸組織SOD、MDA、TNF-α水平()

表3 各組大鼠睪丸組織SOD、MDA、TNF-α水平()

與C組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01;與HF組比較,#P<0.05,##P<0.01。

組別 n SOD/NU·mg-1 MDA/nmol·mg-1 TNF-α/ng·mg-1 C 10 306.85±57.55 9.90±2.73 147.46±39.94 HF 12 221.59±87.31＊ 15.43±4.31＊＊ 193.34±19.62＊HE 13 318.44±45.69## 8.08±4.55## 159.39±16.71#HZ 12 314.01±79.30## 9.33±2.72## 155.44±28.85#HZE 13 341.93±76.46## 9.93±2.05## 155.64±24.27#

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:長(zhǎng)期高脂膳食使得大鼠體質(zhì)量略低于對(duì)照組,其腎周、睪周脂肪墊和血液中脂肪、膽固醇含量明顯升高。這與部分學(xué)者及本研究前期[3-4]的結(jié)果相一致:長(zhǎng)期高脂膳食誘導(dǎo)大鼠肥胖抵抗及脂代謝異常。有研究[5]認(rèn)為高脂飲食可誘發(fā)睪丸系數(shù)降低、動(dòng)物陰莖短小等生殖系統(tǒng)發(fā)育障礙。持續(xù)高脂飲食飼喂小鼠后睪丸系數(shù)和附睪系數(shù)都明顯低于對(duì)照,且精子活動(dòng)度明顯低于正常小鼠[4-6]。由此可見(jiàn)本研究結(jié)果與大多數(shù)學(xué)者研究一致,長(zhǎng)期高脂飲食引發(fā)大鼠脂肪沉積、脂代謝異常,進(jìn)而影響大鼠內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、激素分泌、生長(zhǎng)發(fā)育等功能,而睪丸組織結(jié)構(gòu)和功能的正常是維持生殖功能的前提條件。

目前研究[7-10]認(rèn)為適宜濃度的TNF-α對(duì)睪丸功能有重要的調(diào)節(jié)作用,但濃度過(guò)高時(shí)則產(chǎn)生毒性作用。高濃度的TNF-α可抑制睪酮的基礎(chǔ)分泌,明顯降低Leydig細(xì)胞生存率,并引發(fā)細(xì)胞凋亡峰。TNF-α還可激發(fā)精子產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),產(chǎn)生大量具有細(xì)胞毒性的活性氧或氧自由基,消耗大量SOD或使其活性下降,從而產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧等現(xiàn)象。MDA含量可反映機(jī)體細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化和機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的損傷程度。有研究[11]報(bào)道,高能膳食引起肥胖大鼠脂質(zhì)代謝紊亂,可以誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激現(xiàn)象,并影響機(jī)體的抗氧化能力,增強(qiáng)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化損害。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證:高脂膳食誘導(dǎo)肥胖并引發(fā)TNF-α水平明顯升高,進(jìn)而出現(xiàn)血液和睪丸組織中MDA明顯升高、SOD明顯下降現(xiàn)象。因此高脂膳食大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)改變,可能因?yàn)殚L(zhǎng)期高脂飲食誘發(fā)TNF-α增加、機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)而引起的。

本研究結(jié)果表明:高脂飲食大鼠經(jīng)游泳運(yùn)動(dòng)或補(bǔ)充消脂散后,睪丸組織生精小管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞基本發(fā)育正常,排列整齊,管腔可見(jiàn)大量成熟精子,管間可見(jiàn)疏松的間質(zhì)組織;運(yùn)動(dòng)組細(xì)胞脫落現(xiàn)象明顯減弱;中藥組大鼠生精細(xì)胞與基底膜間出現(xiàn)的脫離組織體積明顯變小?？梢?jiàn)游泳運(yùn)動(dòng)與補(bǔ)充復(fù)方中藥消脂散明顯改善高脂膳食誘導(dǎo)的大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)變異。實(shí)驗(yàn)中同步得出的結(jié)果是:游泳運(yùn)動(dòng)或補(bǔ)充消脂散后大鼠TG、TC、腎周和睪周脂肪墊明顯降低,血液和睪丸組織中MDA、TNF-α明顯下降、SOD明顯上升。本研究推測(cè)大鼠游泳運(yùn)動(dòng)和補(bǔ)充消脂散后降低脂肪沉積,降低TNF-α的分泌和脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生,進(jìn)而調(diào)節(jié)高脂膳食大鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

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