程 亮， 趙洪海， 曾國慶， 張同恩， 王少杰， 石 磊， 王承云， 夏 春，△

(1福建醫(yī)科大學(xué)協(xié)和臨床醫(yī)學(xué)院， 福建 福州 350000； 2廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科， 福建 廈門 361000)

1000-4718(2012)05-0889-06

2011-10-26

2012-02-29

福建省自然科學(xué)基金資助項目(No.2010D007)；福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題資助(No. 2011-CXB-36)

△通訊作者 Tel: 0592-2993080; E-mail: chunxia99@yahoo.com.cn

Akt與ERK1/2在人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的表達(dá)*

程 亮1， 趙洪海2， 曾國慶2， 張同恩2， 王少杰2， 石 磊2， 王承云2， 夏 春1，2△

(1福建醫(yī)科大學(xué)協(xié)和臨床醫(yī)學(xué)院， 福建 福州 350000；2廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科， 福建 廈門 361000)

目的觀察蛋白激酶B(Akt)與細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)在正常和骨關(guān)節(jié)炎(OA)軟骨細(xì)胞中的表達(dá)，探討Akt與ERK1/2在OA病程中的意義。方法手術(shù)中取5例正常和18例OA人膝關(guān)節(jié)軟骨組織，包埋制備切片，免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察 p-Akt及p-ERK1/2在正常和OA 軟骨組織中的表達(dá)；培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞，甲苯胺藍(lán)染色、免疫組化鑒定并觀察聚集蛋白聚糖及Ⅱ型膠原在正常和OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)； Western blotting技術(shù)檢測Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2、磷酸化70 kD核糖體蛋白S6激酶(p-p70S6K)及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白在正常和OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)水平； 實時熒光定量PCR技術(shù)檢測聚集蛋白聚糖及Ⅱ型膠原在正常和OA軟骨細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平。結(jié)果與正常軟骨細(xì)胞比較，OA軟骨細(xì)胞內(nèi)p-Akt和p-p70S6K蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，且聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原mRNA和蛋白在OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平降低(P<0.05)，而 p-ERK1/2和PCNA蛋白表達(dá)明顯提高(P<0.05)。結(jié)論Akt可能通過p-p70S6K來調(diào)控OA軟骨細(xì)胞外基質(zhì)聚集蛋白聚糖及II型膠原的合成，ERK1/2可能通過PCNA來調(diào)控OA軟骨細(xì)胞增殖；Akt與ERK1/2可能參與了OA的病理過程。

骨性關(guān)節(jié)炎； 軟骨細(xì)胞； 蛋白激酶B； 細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)MAP激酶類； 蛋白合成； 細(xì)胞增殖

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病,是引起中老年人關(guān)節(jié)疼痛的常見原因之一。流行病學(xué)調(diào)查表明,55歲以上中老年人OA的發(fā)病率為44%～70%,其中10%表現(xiàn)為各種功能障礙，且65歲以上的人群中的OA發(fā)病率男性為60%,女性為70%[1-2]。隨著世界老齡化人口的增加,OA的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升趨勢。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞，在軟骨形成、代謝以及修復(fù)中起著舉足輕重的作用[3]。蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又稱Akt)是絲氨酸/酪氨酸家族成員之一，可促進(jìn)細(xì)胞合成信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，研究發(fā)現(xiàn)激活A(yù)kt可促進(jìn)人骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原(type II collagen, COL2)、聚集蛋白聚糖(aggrecan,AGG)等分泌增多[4]。同時，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2, ERK1/2)可促進(jìn)細(xì)胞增殖信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活ERK1/2信號通路可促進(jìn)人骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖，而ERK1/2特異性抑制劑可抑制細(xì)胞增殖反應(yīng)[5]。但是，有關(guān)這2種信號分子在OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)及相關(guān)功能了解尚少，本實驗取人正常和OA組織制備切片；建立人正常和OA軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，觀察p-Akt和p-ERK1/2 在正常和OA軟骨組織及細(xì)胞中的表達(dá)差異，以期為臨床探討OA的病理生理提供一定的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1標(biāo)本

OA膝關(guān)節(jié)軟骨組織取材自接受膝關(guān)節(jié)表面置換的 OA患者[18人，男性8 人，女性 10 人，平均年齡 62.7 歲(53～72歲) ]。OA 診斷依據(jù)美國風(fēng)濕病協(xié)會 2001 年版指南。正常軟骨組織取材于因車禍需截肢患者[5人，男性 4人，女性 1人，平均年齡27歲(18～35 歲) ]，排除關(guān)節(jié)疾病病史。軟骨標(biāo)本取材均經(jīng)過患者或家屬知情同意。

2方法

2.1軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、細(xì)胞爬片及鑒定 術(shù)中無菌條件下取軟骨，迅速在冷凍條件下帶入無菌操作臺，置于含雙抗(HyClone)的PBS液中將軟骨剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入含 0.02% EDTA 的0.25%胰蛋白酶(Gibco)在37 ℃溫箱孵30 min，1 000 r/min 離心7 min，棄上清，加入0.2%Ⅱ型膠原酶(Sigma)在37 ℃溫箱消化過夜[6]，200目濾網(wǎng)過濾，離心棄上清，PBS液漂洗3次，收集細(xì)胞，加入含10% 胎牛血清(Gibco)的高糖 DMEM 培養(yǎng)基(HyClone)，將細(xì)胞均勻接種于培養(yǎng)皿中，置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行原代培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并細(xì)胞爬片行甲苯胺藍(lán)染色(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)及Ⅱ、Ⅹ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定(試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

2.2Western blotting檢測 貼壁生長的人軟骨細(xì)胞長至70%～80%匯合，0.25%胰酶+0.02%EDTA消化，收集細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)[含1%PMSF(Sangon)、1%蛋白磷酸酶抑制劑(購自普利萊基因技術(shù)有限公司)和1%DTT(Sangon)],充分混勻，冰水浴45 min，每間隔5 min振蕩混均1次；4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，收集上清， BCA蛋白檢測試劑盒(Pierce)定量，-20 ℃保存。取40 μg細(xì)胞總蛋白按常規(guī)方法進(jìn)行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移法將蛋白印跡轉(zhuǎn)移至PVDF膜(GE)上，5%脫脂奶粉封閉。Ⅰ抗4 ℃過夜[Akt抗體、p-Akt抗體、ERK1/2抗體、p-ERK1/2抗體和磷酸化70 kD核糖體蛋白S6激酶(phosphorylated 70-kD ribosomal protein S6 kinase,p-p70S6K)抗體購自Cell Signaling Technology，稀釋度分別為：1∶4 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶3 000；GAPDH抗體和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抗體購自Epitomics，稀釋度分別為1∶4 000和1∶1 000]；Ⅱ抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG(Proteinteach Group)，25 ℃恒溫下1 h，ECL(Millipore)發(fā)光法測定反應(yīng)條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參照，計算相對值。

2.3實時熒光定量PCR檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)Trizol(Invitrogen)法抽提細(xì)胞總RNA，定量。逆轉(zhuǎn)錄條件為：42 ℃逆轉(zhuǎn)錄60 min，-20 ℃保存。Real-time PCR條件為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。反應(yīng)體系構(gòu)成: cDNA 模板2 μL、MaximaTMSYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2×) (Fermentas)10 μL、上下游引物(300 nmol/L)各 1 μL、DEPC H2O 6 μL；引物序列見表1[7]；PCR反應(yīng)采用 Applied Biosystems 7500系統(tǒng)(ABI) ，觀察AGG和COL2 mRNA在正常和 OA軟骨細(xì)胞之間的表達(dá)差異，實驗重復(fù) 3 次。組間差異應(yīng)用 2-ΔΔCt法計算。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，一般恒壓130 V、30 min即可,Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)顯像。

表1 Real-time PCR 引物序列

2.4免疫組化檢測 術(shù)中取材的軟骨組織4%多聚甲醛固定1周， EDTA脫鈣液脫鈣2周，修整組織標(biāo)本后梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片(厚度 4 μm)，貼片后經(jīng)60 ℃烘烤過夜。二甲苯、乙醇梯度入水，用PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次3 min，然后用抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)。滴加過氧化酶阻斷溶液，室溫孵育10 min后，用PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次3 min，滴加正常非免疫動物血清，室溫孵育10 min后，滴加Ⅰ抗，4 ℃過夜。用PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次3 min，滴加生物素標(biāo)記的第Ⅱ抗體，室溫孵育10 min后，用PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次3 min，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物溶液，室溫孵育10 min后，用PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次3 min。添加 DAB 顯色，顯微鏡下觀察3～10 min，充分水洗后蘇木素復(fù)染，自來水沖洗返藍(lán)，再經(jīng)過梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察結(jié)果，圖像資料導(dǎo)入 Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行分析。陽性表達(dá)細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)為: 細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕色染色的顆?；虬邏K,并采用細(xì)胞內(nèi)顆粒或斑塊表達(dá)量進(jìn)行定量分析。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1軟骨細(xì)胞的形態(tài)及鑒定

分離培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞外觀呈多角形，胞質(zhì)豐富，胞核清楚，核為圓形或橢圓形，位于胞體中心，核仁為1～3個，細(xì)胞折光性好，且呈集落生長。甲苯胺藍(lán)染色使正常軟骨細(xì)胞胞漿呈藍(lán)色，可見1～3個核仁，呈紫藍(lán)色,見圖1 A1；OA軟骨細(xì)胞相對于正常軟骨細(xì)胞，胞漿染色稍淺,見圖1A2。正常軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫組化染色呈陽性反應(yīng)，細(xì)胞胞漿內(nèi)有黃色顆粒，胞核基本無著色,見圖1B1；OA軟骨細(xì)胞相對于正常軟骨細(xì)胞，胞漿顆粒顏色稍淺,見圖1B2。正常軟骨細(xì)胞X型膠原免疫組化染色呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)均有棕黃色顆粒,見圖1C2；OA軟骨細(xì)胞相對于正常軟骨細(xì)胞，胞漿和胞核內(nèi)顆粒顏色稍深,見圖1C1。

2人正常和OA軟骨細(xì)胞中Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2、p-p70S6K和PCNA的表達(dá)水平

Western blotting檢測顯示,OA軟骨細(xì)胞中Akt和ERK1/2表達(dá)水平與正常軟骨細(xì)胞相比無明顯差異(P>0.05),見圖2；與正常軟骨細(xì)胞相比，OA軟骨細(xì)胞中p-Akt和p-p70S6K表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2；OA軟骨細(xì)胞中p-ERK1/2和PCNA表達(dá)水平與正常軟骨細(xì)胞相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

3人正常和OA軟骨細(xì)胞中COL2和AGGmRNA的表達(dá)水平

Real-time PCR結(jié)果顯示，與人正常軟骨細(xì)胞相比，OA軟骨細(xì)胞中COL2和AGG mRNA表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

Figure 1. The identification of the normal and osteoarthritic (OA) chondrocytes.A1: the expression of aggrecan in OA chondrocytes(toluidine blue staining,×200)；A2：the expression of aggrecan in normal chondrocytes(toluidine blue staining,×200)；B1: the expression of type II collagen in OA chondrocytes(immunocytochemical staining,×200)；B2：the expression of type II collagen in normal chondrocytes(immunocytochemical staining,×200)；C1：the expression of type X collagen in normal OA chondrocytes(immunocytochemical staining,×200)；C2：the expression of type X collagen in normal chondrocytes(immunocytochemical staining,×200).

圖1正常和OA軟骨細(xì)胞的鑒定

圖2正常和OA細(xì)胞中Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2、p-p70S6K和PCNA蛋白表達(dá)水平

4人正常和OA軟骨組織中Akt和ERK1/2表達(dá)水平

免疫組化結(jié)果顯示正常和OA軟骨組織內(nèi)軟骨細(xì)胞中均有p-Akt表達(dá)，分布在細(xì)胞胞漿內(nèi)；且p-Akt在OA軟骨組織中整體表達(dá)水平低于正常軟骨組織,見圖4A、B。而正常和OA軟骨組織內(nèi)軟骨細(xì)胞胞漿與胞核中均表達(dá)p-ERK1/2，但p-ERK1/2在OA軟骨組織中整體表達(dá)水平明顯高于正常軟骨組織，見圖4C、D。

討 論

傳統(tǒng)觀點認(rèn)為軟骨基質(zhì)的合成和降解失衡是OA的主要發(fā)病機(jī)制，軟骨細(xì)胞作為軟骨組織中唯一的細(xì)胞，在細(xì)胞外基質(zhì)(即膠原和蛋白聚糖)的合成、分解以及相應(yīng)功能的維持方面具有重要作用。在OA病變過程中，軟骨細(xì)胞經(jīng)歷了肥大分化、終末分化、礦化等變化過程，而細(xì)胞功能也隨之發(fā)生變化，即合成分泌的膠原和蛋白多糖的類型發(fā)生改變以及受到病理刺激后的反應(yīng)性增殖等。如軟骨細(xì)胞病變可引起細(xì)胞外基質(zhì)包括膠原蛋白類型及聚集蛋白聚糖分子大小等顯著改變，對OA的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生決定性的影響[8];正常軟骨細(xì)胞是沒有增殖能力的,而OA軟骨細(xì)胞與之相比有一定的增殖能力[9]。因此,軟骨細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)是OA病程的關(guān)鍵。

圖3正常和OA軟骨組織細(xì)胞中II型膠原和聚集蛋白聚糖mRNA表達(dá)水平

Figure 4. p-Akt and p-ERK1/2 expression in the normal and OA cartilage (immunohistochemical staining,×400).A: the expression of p-Akt in OA cartilage；B: the expression of p-Akt in normal cartilage；C: the expression of p-ERK1/2 in OA cartilage；D: the expression of p-ERK1/2 in normal cartilage.

圖4p-Akt和p-ERK1/2在正常和OA軟骨組織中的表達(dá)

眾多信號通路參與軟骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)，其中作為PI3K-Akt信號通路的關(guān)鍵酶，已有研究顯示Akt通過磷酸化作用后使其活化，導(dǎo)致AGG和COL2合成和表達(dá)顯著上升，抑制PI3K/Akt可使軟骨細(xì)胞AGG和COL2合成下降[10]。

前期工作及本實驗均顯示OA軟骨組織中p-Akt表達(dá)降低[11]，并且這里還證實p-Akt表達(dá)在OA軟骨細(xì)胞中明顯下降，并且其下游底物之一p70S6K的磷酸化水平也同步下降，表明OA 中Akt/p70S6K通路受到抑制。p70S6SK作為Akt的下游激酶，其發(fā)生磷酸化可導(dǎo)致核糖體蛋白合成的開始和增加。進(jìn)一步觀察顯示作為軟骨基質(zhì)主要成分的AGG和COL2在OA軟骨細(xì)胞內(nèi)的mRNA水平也呈下降趨勢。即與正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞比較，在OA軟骨細(xì)胞中伴隨Akt/p70S6K的抑制，AGG和COL2 mRNA水平也出現(xiàn)同步下降，結(jié)合以往學(xué)者的觀察結(jié)果,提出OA軟骨細(xì)胞內(nèi)Akt/p70S6K通路的抑制可能與AGG和COL2 mRNA水平降低相關(guān)，推測可能正是Akt/p70S6K的抑制導(dǎo)致軟骨細(xì)胞正常分化表型COL2和AGG表達(dá)水平下降。當(dāng)然Akt/p70S6K的通路受抑制不僅限于對蛋白合成的影響，可能也涉及到細(xì)胞增殖、存活調(diào)節(jié)等，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

MAPK-ERK1/2信號通路是把細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到核內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)的重要細(xì)胞內(nèi)信號分子，是不同促增殖因子調(diào)控的共同通路，參與多種細(xì)胞的增殖、分化[12]。本研究結(jié)果顯示p-ERK1/2在OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)水平較正常軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，并在組織中也發(fā)現(xiàn)了p-ERK1/2在OA軟骨組織中的表達(dá)上調(diào)。而且同時我們檢測到作為細(xì)胞增殖狀態(tài)指標(biāo)之一的PCNA[13]在OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)呈上調(diào)趨勢，揭示出OA軟骨細(xì)胞增殖能力可能強(qiáng)于正常軟骨細(xì)胞。顯而易見，ERK1/2參與調(diào)控OA軟骨細(xì)胞的病理改變，并可能通過調(diào)控PCNA而致OA軟骨細(xì)胞增殖能力增加。

眾所周知OA的病理發(fā)展是一個復(fù)雜的并受多種信號通路調(diào)節(jié)影響的過程，它不受任一信號通路(包括Akt和ERK1/2)單獨調(diào)節(jié)。在任何時候軟骨細(xì)胞內(nèi)都有大量信號通路的激活，各信號通路之間的相互串話、正負(fù)反饋循環(huán)以及大量信號整合的結(jié)果決定軟骨細(xì)胞最后的反應(yīng)(包括軟骨細(xì)胞的合成代謝、分解代謝、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等等)。例如有研究表明Akt信號通路也參入調(diào)控OA軟骨細(xì)胞增殖，ERK1/2信號通路也參入調(diào)控OA軟骨細(xì)胞蛋白合成[9-14]。雖然本文的結(jié)果支持Akt的生物功能可能與OA軟骨細(xì)胞蛋白合成功能相關(guān)聯(lián)，ERK1/2的生物功能可能與OA軟骨細(xì)胞增殖相關(guān)聯(lián)，但軟骨細(xì)胞 II 型膠原等產(chǎn)物的合成代謝可能受到其它信號調(diào)控因子的綜合影響，不能以Akt調(diào)控“一元論”解釋；軟骨細(xì)胞的增殖反應(yīng)也可能受到其它信號調(diào)控因子的綜合影響，不能以ERK1/2調(diào)控“一元論”解釋；如生長激素、表皮生長因子、胰島素、腫瘤壞死因子-α等也參入軟骨細(xì)胞的合成代謝、分解代謝、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等調(diào)控[15-17]。

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ExpressionofAktandERK1/2inhumanosteoarthriticchondrocytes

CHENG Liang1, ZHAO Hong-hai2, ZENG Guo-qing2, ZHANG Tong-en2, WANG Shao-jie2, SHI Lei2, WANG Cheng-yun2, XIA Chun1,2

(1UnionSchoolofClinicalMedicine,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350000,China;2DepartmentofOrthopaedics,ZhongshanHospitalofXiamenUniversity,Xiamen361000，China;E-mail:chunxia99@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the expression of protein kinase B (Akt) and extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) in normal and osteoarthritic chondrocytes.METHODSThe samples of knee cartilage were obtained from the normal donors (n=5) and the patients (n=18) undergoing total knee arthroplasty with the diagnosis of osteoarthritis (OA). The expression of p-Akt and p- ERK1/2 in the normal and osteoarthritic cartilage tissues was detected by the method of immunohistochemistry. The chondrocytes were isolated and identified by toluidine blue staining and immunohistochemical method. The expression levels of Akt, p-Akt, ERK1/2,p-ERK1/2,phosphorylated 70-kD ribosomal protein S6 kinase(p-p70S6K) and proliferating cell nuclear antigen(PCNA) were tested in normal and osteoarthritic chondrocytes by Western blotting. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to measured the expression levels of aggrecan and type II collagen gene in normal and osteoarthritic chondrocytes.RESULTSThe expression of p-Akt in normal cartilage was higher than that in OA cartilage. The expression of p- ERK1/2 in OA cartilage was higher than that in normal cartilage. Compared with the normal chondrocytes, the expression of p-Akt and p-p70S6K, and the mRNA levels of aggrecan and type II collagen were increased (P<0.05), and the expression of p-ERK1/2 and PCNA was decreased in OA chondrocytes (P<0.05).CONCLUSIONAkt might regulate aggrecan and type II collagen synthesis via p-p70S6K, and ERK1/2 might regulate OA chondrocyte proliferation through PCNA. Both Akt and ERK1/2 play important roles in the pathogenesis of OA.

Osteoarthritis; Chondrocytes; Protein kinase B; Extracellular signal-regulated MAP kinases; Protein synthesis; Cell proliferation

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.021