孫曉東, 劉杏娥

(1浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院普外科， 浙江 杭州 310016； 2浙江醫(yī)院腫瘤科， 浙江 杭州 310013)

1000-4718(2012)06-0996-05

2011-12-19

2012-03-22

浙江省自然科學基金資助項目(No.Y2100434)

△通訊作者 Tel: 0571-87987373;E-mail: xingel@sohu.com

姜黃素通過抑制Ras-ERK和Shh-GLI1信號誘導胰腺癌細胞凋亡*

孫曉東1, 劉杏娥2△

(1浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院普外科， 浙江 杭州 310016；2浙江醫(yī)院腫瘤科， 浙江 杭州 310013)

目的探討姜黃素對胰腺癌PANC-1細胞的影響及可能機制。方法不同濃度的姜黃素作用于PANC-1細胞后，采用MTT法檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞凋亡，Western blotting檢測K-Ras、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK1/2)、Sonic hedgehog(Shh)和膠質(zhì)瘤相關癌基因同系物1(GLI1)的表達水平。結(jié)果不同濃度的姜黃素與PANC-1細胞共培養(yǎng)后，濃度為30 mmol/L的姜黃素組能明顯抑制PANC-1細胞的增殖, 與其余各組相比，差異顯著(P<0.01)。PANC-1細胞經(jīng)30 mmol/L姜黃素處理后，其細胞凋亡率(37.57%)明顯高于對照組(4.62%)(P<0.01)。經(jīng)姜黃素處理的PANC-1細胞，其K-Ras、p-ERK、Shh和GLI1表達明顯低于對照組(均P<0.01)。結(jié)論姜黃素通過抑制Ras-ERK和Shh-GLI1信號通路的活化，抑制胰腺癌PANC-1細胞增殖，并誘導細胞凋亡。

姜黃素； 胰腺腫瘤； Hedgehog; Ras-ERK通路; Shh-GLI1通路

姜黃素(curcumin)是一種從姜科植物姜黃中提取的酚化合物，具有強烈的抗炎、抗氧化、抗突變等特性[1]。近年來的研究表明，姜黃素可通過多種機制抑制多種腫瘤細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導凋亡，并能提高腫瘤細胞對化療藥物和放療的敏感性[2-3]。

胰腺癌細胞中K-ras基因的突變率可達70%～100%，提示K-Ras信號在胰腺癌的起始、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用[4]。Hedgehog(Hh)信號通路的異常激活在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵潤及轉(zhuǎn)移中也起重要作用[5-6]。我們通過研究姜黃素對胰腺癌細胞體外增殖、細胞凋亡等影響，同時檢測K-Ras、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2,p-ERK1/2)、Sonic hedgehog(Shh)和膠質(zhì)瘤相關癌基因同系物1(glioma-associated oncogene homolog 1,GLI1)蛋白表達水平，探討姜黃素對胰腺癌細胞的作用及可能的分子機制。

材 料 和 方 法

1細胞株及主要試劑

PANC-1(K-ras突變)胰腺癌細胞購自中科院上海細胞庫。姜黃素為Sigma產(chǎn)品。兔抗人K-Ras、ERK1/2、p-ERK1/2、Shh和GLI1 Ⅰ抗為Cell Signaling產(chǎn)品，鼠抗兔Ⅱ抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購自聯(lián)科生物技術有限公司。DMEM、胎牛血清為Gibco產(chǎn)品。MTT為Sigma產(chǎn)品。

2方法

2.1MTT法檢測細胞增殖抑制率 胰腺癌細胞經(jīng)DMEM常規(guī)培養(yǎng)后用0.25%胰酶消化, 以1×107/L接種于96 孔培養(yǎng)板中，37 ℃過夜。將細胞分對照組和姜黃素處理組(10 mmol/L、20 mmol/L和30 mmol/L)，培養(yǎng)48 h后將96孔板中的細胞以500×g離心3 min，棄100 μL上清液，加MTT 10 μL(5 g/L)，37 ℃ 孵育4 h，加DMSO 100 μL，振蕩10 min后上酶標免疫測定儀檢測A490值。細胞增殖抑制率(%)= (1-處理組A/對照組A)×100%。

2.2采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測姜黃素誘導胰腺癌細胞凋亡的實驗 按試劑盒說明書操作，PANC-1細胞經(jīng)DMEM常規(guī)培養(yǎng)后用0.25%胰酶消化, 以1×108/L接種于6 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，將細胞分為對照組和姜黃素處理組(10 mmol/L、20 mmol/L和30 mmol/L )。經(jīng)48 h處理后胰酶消化收集細胞，經(jīng)800×g、離心5 min，再經(jīng)PBS洗3次，分別加緩沖液50 μL、V-FITC 5 μL和PI 10 μL，避光5 min以上，行流式細胞術檢測。

2.3姜黃素對ERK1/2磷酸化的影響 應用Western blotting技術檢測K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2表達水平。PANC-1細胞經(jīng)DMEM常規(guī)培養(yǎng)，用0.25%胰酶消化后, 以1×108/L接種于6 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，將細胞分對照組和姜黃素30 mmol/L處理組，48 h后收集各組細胞，一步法裂解細胞，13 000 r/min離心10 min，取上清液進行蛋白定量。常規(guī)制備10%SDS-PAGE分離膠和積層膠。每孔上樣蛋白量50 μg，加4×上樣緩沖液，混勻后煮沸5 min，上樣后100 V電泳至染料跑出膠。輕輕取下膠，用Millipore H2O洗膠1次，100 V轉(zhuǎn)膜2 h，用封閉液37 ℃封閉2 h，加入相應的Ⅰ抗(1∶1 000)4 ℃過夜，TBST洗膜4次，每次10 min，加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶5 000)室溫1 h，TBST洗膜4次，每次10 min，最后加ECL液曝光顯色。結(jié)果用Band Leader軟件進行條帶灰度半定量分析。

2.4姜黃素對Shh和GLI1表達的影響 應用Western blotting技術檢測Shh和GLI1的表達水平。同方法2.3，結(jié)果用Band Leader軟件進行條帶灰度半定量分析。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1MTT檢測增殖結(jié)果

隨著姜黃素濃度的逐漸增加，PANC-1細胞的增殖抑制率也逐漸增加，10 mmol/L姜黃素處理組與對照組相比，PANC-1細胞的增殖明顯被抑制，差異顯著(P<0.01)；20 mmol/L姜黃素處理組與10 mmol/L姜黃素處理組相比，PANC-1細胞的增殖抑制差異不顯著(P>0.05),與對照組相比，細胞增殖明顯被抑制，差異顯著(P<0.01)；30 mmol/L姜黃素處理組與20 mmol/L姜黃素處理組相比，PANC-1細胞的增殖明顯被抑制，差異顯著(P<0.01)，與10 mmol/L姜黃素處理組相比，細胞增殖明顯被抑制，差異顯著(P<0.01)，與對照組相比，細胞增殖抑制率明顯增高，差異顯著(P<0.01)，見表1。

表1PANC-1細胞增殖抑制率

GroupGrowthinhibioryrateControl0Curcumin(10mmol/L)12.58±3.52**Curcumin(20mmol/L)15.43±3.63**##Curcumin(30mmol/L)60.21±6.83**##△△

**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vs10 mmol/L curcumin group；△△P<0.01vs20 mmol/L curcumin group.

2流式細胞術檢測凋亡結(jié)果

流式細胞術檢測姜黃素誘導PANC-1細胞凋亡的結(jié)果見圖1、表2。10 mmol/L姜黃素處理組與對照組相比，PANC-1細胞的凋亡率明顯增高，差異顯著(P<0.01)；20 mmol/L姜黃素處理組與10 mmol/L姜黃素處理組相比，凋亡率無顯著差異(P>0.05)，與對照組相比，凋亡率明顯增高，差異顯著(P<0.01)；30 mmol/L姜黃素處理組與20 mmol/L姜黃素處理組相比，PANC-1細胞的凋亡率明顯增高，差異顯著(P<0.01)，與10 mmol/L姜黃素處理組相比，凋亡率明顯增高，差異顯著(P<0.01)，與對照組相比，凋亡率也明顯增高，差異顯著(P<0.01)。

Figure 1. Apoptosis of PANC-1 cells detected by flow cytometry.A: control group;B:curcumin treatment group(30 mmol/L).

圖1PANC-1細胞的凋亡

表2PANC-1細胞凋亡率

GroupApoptoticrateControl4.26±0.26Curcumin(10mmol/L)7.97±0.55**Curcumin(20mmol/L)8.48±0.55**##Curcumin(30mmol/L)37.57±1.46**##△△

**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vs10 mmol/L curcumin group；△△P<0.01vs20 mmol/L curcumin group.

3姜黃素抑制PANC-1細胞K-Ras的表達及ERK1/2磷酸化水平

與對照組相比，K-Ras在姜黃素組中的表達明顯降低，差異顯著(P<0.05)；與對照組相比，ERK1/2在姜黃素組中的表達無明顯變化(P>0.05)；與對照組相比，p-ERK1/2在姜黃素組中的表達明顯降低，差異顯著(P<0.01)。這些結(jié)果提示姜黃素可抑制PANC-1細胞K-Ras及其下游信號分子的活化，見圖2。

圖2Westernblotting檢測K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2的表達

4姜黃素抑制PANC-1細胞Shh和GLI1的表達

與對照組相比，Shh在姜黃素組中的表達明顯降低，差異顯著(P<0.01)；與對照組相比，GLI1在姜黃素組中的表達明顯降低，差異顯著(P<0.01)。這些結(jié)果提示姜黃素可抑制Hedgehog信號通路，見圖3。

圖3Westernblotting檢測Shh和GLI1的表達

討 論

多條信號通路的異常和持續(xù)活化是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵潤、轉(zhuǎn)移及復發(fā)、耐藥等的主要機制[7-8]。研究表明，姜黃素因具有抗炎、抗HIV-1、抗肺纖維化、預防腫瘤、抑制腫瘤、放化療增敏等多種藥理活性作用，近年來在腫瘤領域受到極大關注。姜黃素對多種腫瘤細胞，包括乳腺癌、胃癌、大腸癌、肺癌、胰腺癌等均具有化學預防及治療作用[7，9]。姜黃素抗腫瘤作用的機制主要是通過調(diào)節(jié)多條信號通路分子，如下調(diào)EGFR、HER-2、Shh/GLI1、Wnt/β-catenin及其下游信號分子ERK、Akt、NF-κB、STATs等，上調(diào)p21、p27、細胞周期激酶抑制劑等[8，10-12]。

在胰腺癌中，姜黃素具有抑制胰腺癌細胞增殖、誘導凋亡、抗血管生成、化療增敏等作用，其機制尚未完全清楚，可能與姜黃素能抑制EGFR、STAT-3、NF-κB及其下游靶基因——多藥耐藥相關蛋白5表達等有關[13-16]。姜黃素通過下調(diào)NF-κB依賴基因和Sp1、Sp2、Sp3轉(zhuǎn)錄因子抑制Panc28和L3.6pL胰腺癌細胞增殖[13]。姜黃素腹腔內(nèi)注射能抑制裸鼠L3.6pL胰腺癌細胞移植瘤的生長[15]。姜黃素還能提高吉西他濱對BxPC-3、Panc-1和Miapaca-2胰腺癌細胞的抗增殖及誘導凋亡效應[13，16]。在胰腺癌動物模型中，姜黃素和吉西他濱聯(lián)合應用比吉西他濱單藥更有效地抑制腫瘤生長及抗血管生成[13，16]。姜黃素的化療增敏作用部分是通過抑制STAT-3和NF-κB調(diào)節(jié)基因如cyclins、c-myc、bcl-2、bcl-XL、MMPs、VEGF等的表達[13，16]。

在所有惡性腫瘤中，胰腺癌的K-ras基因突變率最高，可達70%～100%。K-ras基因突變后，轉(zhuǎn)為癌基因，其表達產(chǎn)物Ras 蛋白發(fā)生構(gòu)型改變，功能也隨之改變，不需外界生長信號的刺激便自身活化，主要通過Ras-Raf- MEK - ERK等信號轉(zhuǎn)導途徑，影響細胞的生長、分化和凋亡等。K-ras基因突變是胰腺癌發(fā)生過程中的早期分子事件，在胰腺癌的起始、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用[3]。

Hh信號通路是一條高度保守的信號轉(zhuǎn)導通路，主要由信號分子Shh、膜受體Patched(Ptch)、Smoothened (Smo)和下游的核轉(zhuǎn)錄因子GLI組成(即Shh-Ptch-Smo-GLI)。GLI的靶基因涉及到腫瘤細胞的生長、凋亡、轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、新生血管形成等多個方面[17]。近年來的研究表明，Hh/GLI信號通路的異常激活在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵潤及轉(zhuǎn)移中起重要作用[4-5]。

而有關Hh和Ras- Raf-MEK-ERK信號通路之間串聯(lián)對話的報道很少。研究發(fā)現(xiàn)，在Hh/GLI信號介導的腫瘤發(fā)展過程中，其它癌基因產(chǎn)物(如突變的K-Ras)以及Hh與不同生長因子，包括酪氨酸激酶受體[如表皮生長受體EGFR、Wnt/β-catenin和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)/TGF-β受體]之間的串聯(lián)對話同樣起著重要作用[18]。Morton等[19]的研究也發(fā)現(xiàn)，Hh信號通路與活化的K-Ras具有協(xié)同作用，Hh通過降低腫瘤細胞對MAPK和PI3-K/Akt/mTOR信號持續(xù)活化的依賴，從而增強K-Ras誘導的胰腺癌發(fā)生、發(fā)展。但也有研究表明，在胰腺導管腺癌中，Hh信號通路下游的核轉(zhuǎn)錄因子GLI1可不依賴于上游Shh-Ptch-Smo的信號，而受TGF-β和K-Ras信號的調(diào)控[20]。

我們研究姜黃素對PANC-1細胞(K-ras基因突變)的增殖抑制及誘導凋亡作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的姜黃素與PANC-1細胞共培養(yǎng)后，隨著姜黃素濃度的逐漸增加，PANC-1細胞的增殖抑制率也逐漸增加，濃度為30 mmol/L的姜黃素能明顯抑制PANC-1細胞的增殖。PANC-1細胞經(jīng)姜黃素處理后，細胞凋亡率明顯高于對照組，提示姜黃素能在體外誘導PANC-1細胞凋亡，抑制細胞增殖。我們的實驗研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能顯著抑制PANC-1細胞K-Ras的表達和ERK1/2的磷酸化水平。而ERK1/2是K-Ras下游主要的信號分子之一，結(jié)果提示姜黃素能抑制K-Ras及其下游信號分子的活化。我們同時還檢測了Shh和GLI1的表達水平。經(jīng)姜黃素處理后，PANC-1細胞Shh和GLI1的表達水平均明顯下降。GLI1蛋白是Smo下游的轉(zhuǎn)錄因子，在Hh通路中起關鍵作用。GLI1也是Hh信號活化后的靶基因，GLI1表達下降，提示Hh信號通路被抑制。

綜上所述，姜黃素能抑制胰腺癌細胞PANC-1的體外增殖，并可能通過抑制細胞K-Ras下游信號分子ERK1/2的磷酸化和Hedgehog信號通路信號分子Shh、GLI1的表達來誘導PANC-1細胞的凋亡。

[1] 郭魯燕，涂榮波，董 軍,等. 姜黃素對TNF-α損傷大鼠海馬神經(jīng)元的功能性保護作用及機制[J]. 中國病理生理雜志，2010，26(7)：1390-1394.

[2] Goel A, Aggarwal BB. Curcumin, the golden spice from Indian saffron, is a chemosensitizer and radiosensitizer for tumors and chemoprotector and radioprotector for normal organs[J]. Nutr Cancer，2010，62(7):919-930.

[3] Basnet P, Skalko-Basnet N. Curcumin: an anti-inflammatory molecule from a curry spice on the path to cancer treatment[J]. Molecules，2011，16(6): 4567-4598.

[4] Rachagani S, Senapati S, Chakraborty S, et al. Activated KrasG12Dis associated with invasion and metastasis of pancreatic cancer cells through inhibition of E-cadherin[J]. Br J Cancer, 2011,104(6):1038-1048.

[5] Dai J, Ai K, Du Y, et al. Sonic hedgehog expression correlates with distant metastasis in pancreatic adenocarcinoma[J]. Pancreas，2011，40(2):233-236.

[6] Kelleher FC. Hedgehog signaling and therapeutics in pancreatic cancer[J]. Carcinogenesis，2011，32(4):445-451.

[7] Mimeault M, Batra SK. Potential applications of curcumin and its novel synthetic analogs and nanotechnology-based formulations in cancer prevention and therapy[J]. Chin Med，2011，6:31.

[8] Nautiyal J, Banerjee S, Kanwar SS, et al. Curcumin enhances dasatinib-induced inhibition of growth and transformation of colon cancer cells[J]. Int J Cancer，2011，128(4):951-961.

[9] 劉嘉偉，張劍威，楊廣鑫，等. 姜黃素衍生物B50對不同輻射抗拒的同源鼻咽癌細胞增殖及凋亡的作用[J].中國病理生理雜志，2011，27(6)：1077-1083.

[10]Kunnumakkara AB, Anand P, Aggarwal BB. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins[J]. Cancer Lett，2008,269(2):199-225.

[11]Yallapu MM, Maher DM, Sundram V, et al. Curcumin induces chemo/radio-sensitization in ovarian cancer cells and curcumin nanoparticles inhibit ovarian cancer cell growth[J]. J Ovarian Res，2010,3:11.

[12]Aggarwal BB, Banerjee S, Bharadwaj U, et al. Curcumin induces the degradation of cyclin E expression through ubiquitin-dependent pathway and up-regulates cyclin-dependent kinase inhibitors p21 and p27 in multiple human tumor cell lines[J]. Biochem Pharmacol,2007, 73(7):1024-1032.

[13]Kunnumakkara AB, Guha S, Krishnan S, et al. Curcumin potentiates antitumor activity of gemcitabine in an orthotopic model of pancreatic cancer through suppression of proliferation, angiogenesis, and inhibition of nuclear factor-κB-regulated gene products[J]. Cancer Res，2007, 67(8):3853-3861.

[14]Ali S, Ahmad A, Banerjee S, et al. Gemcitabine sensitivity can be induced in pancreatic cancer cells through modulation of miR-200 and miR-21 expression by curcumin or its analogue CDF[J]. Cancer Res，2010, 70(9):3606-3617.

[15]Jutooru I, Chadalapaka G, Lei P, et al. Inhibition of NFκB and pancreatic cancer cell and tumor growth by curcumin is dependent on specificity protein down-regulation[J]. J Biol Chem，2010, 285(33):25332-25344.

[16]Ramachandran C, Resek AP, Escalon E, et al. Potentiation of gemcitabine by Turmeric ForceTMin pancreatic cancer cell lines[J]. Oncol Rep, 2010, 23(6):1529-1535.

[17]Katoh Y, Katoh M. Hedgehog target genes: mechanisms of carcinogenesis induced by aberrant Hedgehog signaling activation[J]. Curr Mol Med, 2009, 9(7):873-886.

[18]Mimeault M, Batra SK. Frequent deregulations in the Hedgehog signaling network and cross-talks with the epidermal growth factor receptor pathway involved in cancer progression and targeted therapies[J]. Pharmacol Rev, 2010, 62(3):497-524.

[19]Morton JP, Mongeau ME, Klimstra DS, et al. Sonic hedgehog acts at multiple stages during pancreatic tumorigenesis[J]. PNAS, 2007, 104(12): 5103-5108.

[20]Nolan-Stevaux O,Lau J,Truitt ML,et al. GLI1 is regulated through Smoothened-independent mechanisms in neoplastic pancreatic ducts and mediates PDAC cell survival and transformation[J]. Genes Dev, 2009, 23(1):24-36.

CurcumininducesapoptosisofpancreaticcancercellsbyinhibitingRas-ERKandShh-GLI1signalpathways

SUN Xiao-dong1, LIU Xing-e2

(1DepartmentofGeneralSurgery,SirRunRunShawHospitalAffiliatedtoZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310016,China;2DepartmentofOncology,ZhejiangHospital,Hangzhou310013,China.E-mail:xingel@sohu.com)

AIM: To investigate the effects of curcumin on pancreatic cancer cells and the possible molecular mechanisms.METHODSThe pancreatic cancer PANC-1 cells were treated with curcumin. Growth inhibitory rate of the cells was measured by MTT assay. Apoptosis of the cells was detected by flow cytometry. The expression levels of K-Ras,extracellular signal-regulated kinase 1/2(ERK1/2),phosphorylated ERK1/2(p-ERK1/2),Sonic hedgehog (Shh) and glioma-associated oncogene homolog 1(GLI1) were determined by Western blotting.RESULTSThe growth inhibitory rate of the cells in 30 mmol/L curcumin group was significantly different from that in other groups. Apoptotic rate in 30 mmol/L curcumin group (37.57%) was significantly higher than that in control group (4.62%). The expression levels of K-Ras, p-ERK1/2, Shh and GLI1 in curcumin groups were significantly lower than those in control group.CONCLUSIONCurcumin inhibits proliferation and induces apoptosis of pancreatic cancer cells by inhibiting Ras-ERK and Shh-GLI1 signal pathways.

Curcumin; Pancreatic neoplasms; Hedgehog; Ras-ERK pathway; Shh-GLI1 pathway

R735.9

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.06.007