胡 畔 ，李瑛，筆雪艷，張清波

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江省食品藥品檢驗(yàn)檢測所，黑龍江 哈爾濱 150001)

金龍丸是由制川烏、制草烏、馬錢子粉、地龍、甘草、天南星(制)、穿山龍、麻黃細(xì)粉組成的醫(yī)院制劑，具有通絡(luò)散結(jié)、祛風(fēng)除濕的功效，用于風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛。原標(biāo)準(zhǔn)收載于1990年版《黑龍江省醫(yī)院制劑規(guī)范》。為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，筆者對(duì)金龍丸的質(zhì)量控制方法進(jìn)行了試驗(yàn)研究，增加了處方中甘草、麻黃的專屬性鑒別，制訂了處方中制川烏、制草烏所含雙酯型生物堿-烏頭堿的限量，增加了處方中馬錢子粉所含士的寧的含量測定，為金龍丸的質(zhì)量控制建立了科學(xué)方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

安捷倫HP1100型高效液相色譜儀。金龍丸(哈爾濱骨傷科醫(yī)院，批號(hào)分別為20100801，20100802，20100803);乙腈為色譜純，其他試劑、試藥均為分析純;士的寧對(duì)照品(批號(hào)為110705-200306，中國藥品生物制品檢定所)。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

甘草的顯微鑒別:取本品，置顯微鏡下觀察，可見纖維束周圍薄壁細(xì)胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維(甘草)。見圖1。

圖1 甘草顯微鑒別圖

麻黃的薄層色譜鑒別:取本品10 g，剪碎，加濃氨試液2 mL，再加三氯甲烷50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，取上清液作為對(duì)照品溶液。另取鹽酸麻黃堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取不含麻黃的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備不含麻黃的陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-濃氨試液(20∶5 ∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照品溶液無干擾。見圖2。

2.2 烏頭堿限量檢查(薄層色譜法)

圖2 麻黃薄層色譜圖

取本品1丸，剪碎，加氨試液2 mL潤濕，加乙醚20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)訜o水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取烏頭堿對(duì)照品加無水乙醇制成每 1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取不含制川烏、制草烏的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備成不含制川烏和制草烏的陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯 -乙醇(32∶18∶5)為展開劑，置氨蒸氣預(yù)飽和的展開缸內(nèi)展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上出現(xiàn)的斑點(diǎn)應(yīng)小于對(duì)照品溶液的斑點(diǎn)，或不出現(xiàn)斑點(diǎn)。見圖3。

2.3 含量測定

圖3 烏頭堿薄層色譜圖

2.3.1 色譜條件

色譜柱:Agilent C18柱(250 mm ×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH至2.8，21∶79);檢測波長:260 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:室溫。理論板數(shù)按士的寧峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

2.3.2 溶液制備

取士的寧對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含50μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。取本品5 g，剪碎，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入濃氨試液2 mL和三氯甲烷50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用鋪有無水硫酸鈉的濾紙濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取不含馬錢子粉的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液

2.3.3 測定法

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，得到金龍丸的色譜分離圖，理論塔板數(shù)為5 000。高效液相色譜圖見圖4。

2.3.4 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn):精密吸取同一對(duì)照品溶液 10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果士的寧峰面積積分值的 RSD為 0.8%(n=5)，表明儀器精密度良好。

線性關(guān)系考察:分別精密吸取對(duì)照品溶液 2，5，10，15，20 μL，注入液相色譜儀，以峰面積 Y為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量 X為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=3 420X+0.160，r=0.999(n=5)。結(jié)果表明，士的寧進(jìn)樣量在0.094 769～0.947 69μg之間與峰面積呈良好線性關(guān)系。

圖4 高效液相色譜圖

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品(批號(hào)為20100801)，按供試品溶液制備方法平行制備5份溶液，按上述色譜條件測定。結(jié)果金龍丸中士的寧的含量均值為0.458 7 mg/g，RSD為2.8%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一批供試品溶液，分別于 0，5，10，15，20 h時(shí)依法測定。結(jié)果金龍丸中士的寧含量的 RSD為2.8%(n=5)，表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):稱取已知含量的同一批樣品約2.5 g，精密稱定，共6份，精密加入士的寧對(duì)照品溶液(0.234 24 mg/g)5 mL，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法操作，按上述色譜條件測定。結(jié)果見表1。

表1 士的寧加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3.5 樣品含量測定

取金龍丸3批樣品，按2.3.2項(xiàng)下方法及2.3.1項(xiàng)下色譜條件測定，根據(jù)所測得峰面積計(jì)算士的寧的含量，結(jié)果分別為1.11，1.12，1.21 mg/丸。

3 討論

采用正己烷-乙酸乙酯-乙醇(32∶18∶5)、甲苯-乙酸乙酯 -二乙胺(14∶1∶1)、正己烷 -乙酸乙酯-甲醇(6.4∶3.6∶1)3種系統(tǒng)，結(jié)果后兩種展開系統(tǒng)均未取得良好的展開效果，故確定正己烷-乙酸乙酯-乙醇(32∶18∶5)作為本檢查的展開劑。

參照2010年版《中國藥典(一部)》中馬錢子[1]47及風(fēng)濕馬錢片[1]584中色譜條件，采用乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH至2.8，21∶79)及甲醇 -水 -醋酸 -三乙胺(65∶200∶2.4∶0.3)為流動(dòng)相，結(jié)果以前者峰形較好，后者存在峰拖尾現(xiàn)象，因此選擇作為本品馬錢子中士的寧含量測定的流動(dòng)相。

取處方中馬錢子粉、地龍、甘草、天南星(制)、穿山龍、麻黃各2 g，按供試品的制備方法制備各藥材溶液按烏頭堿測定法進(jìn)行測定。結(jié)果在藥材馬錢子中在與烏頭堿對(duì)照品相應(yīng)位置處，也出現(xiàn)了相同顏色的斑點(diǎn)。因?yàn)楸痉椒闉躅^堿的限量檢查，所以按本品處方中以制川烏、制草烏中所含烏頭堿的總量計(jì)，顏色不得深于對(duì)照品溶液的斑點(diǎn)即可。

根據(jù)本品處方量折算，參照2010年版《中國藥典(一部)》馬錢子粉[1]48含量測定項(xiàng)下士的寧的含量為0.78%～0.82%，本品中士的寧的含量應(yīng)為“每丸含士的寧1.15～1.22 mg”，為了保證藥物的安全性，確定本品的含量限度上限為“1.22 mg/丸”;同時(shí)考慮大生產(chǎn)過程中損耗對(duì)樣品中士的寧含量測定的影響，將樣品的下限下浮20%，確定本品的含量限度下限為“0.92 mg/丸”。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:47，584，48.