陳 波，賴 星

(1.重慶市第九人民醫(yī)院普外二科，重慶 400700;2.四川省宜賓市第三人民醫(yī)院普外一科，四川 宜賓 466000)

肝臟缺血-再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，I/RI)是導致肝移植后供肝功能低下甚至原發(fā)性無功能的主要原因之一[1]。在原位肝移植過程中，供肝缺血、門靜脈阻斷和血流再灌注不可避免。參附注射液的基本藥理作用為增加冠狀動脈血流及血管灌注量、延長動物耐缺氧時間、保護缺血心肌等[2-3]。因此，本試驗通過建立大鼠原位肝移植模型，觀察參附注射液對移植肝臟的保護作用及其機制，為臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選取健康雄性SD大鼠，體重240～280 g，10～12周齡，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號為SCXK渝20020003。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定試劑盒(Active motif公司);參附注射液(四川雅安三九藥業(yè)有限公司，國藥準字Z51020664)。Beckman CX7型全自動生化分析儀。

1.2 方法

1.2.1 大鼠原位肝移植模型的建立與分組

將SD大鼠分為參附組、對照組和模型組(n=20)。參附組供肝在獲取前經腰靜脈灌注參附注射液(2 mL/100 g)、對照組注入等量生理鹽水，模型組不予處理。切取供肝置于0～4℃ UW保存液內，參照兩袖套法建立同種異體肝移植模型[4];在門靜脈再灌注0，60，180 min后分別處死8只大鼠，抽取下腔靜脈血液5 mL，并切取肝左外葉組織備檢。

1.2.2 肝臟組織的病理學觀察

取左肝前葉肝組織，放入10%中性甲醛溶液中固定24～48 h，常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋，切片(片厚5μm)，HE染色，于光學顯微鏡下觀察。

1.2.3 肝功能檢測

抽腔靜脈血5 mL，血樣于4℃下以4 000 r/min轉速離心，10 min，取上清液置于-70℃冰箱保存。使用全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬酸氨基轉移酶(AST)。根據ELISA試劑盒說明書測定再灌注0，60，180 min后血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。

1.2.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0對資料進行獨立樣本 t檢驗，數(shù)據以X±s表示，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 術后一般情況和病理改變

對照組和模型組大鼠術后180 min內精神萎靡、皮毛粗糙、活動少、不進水、小便黃染;參附組大鼠術后精神較好，可少量活動，可進水。再灌注180 min后，對照組和模型組大量肝細胞壞死，肝小葉結構明顯凌亂，出現(xiàn)空泡樣變，血竇擴張，匯管區(qū)可見大量炎癥細胞浸潤;參附組僅少量肝細胞壞死，肝小葉結構輕度凌亂，肝血竇輕度淤血，少量炎癥細胞浸潤，病理損傷較對照組和模型組輕。

2.2 肝功能指標

結果見表1?？梢?組ALT和AST水平在再灌注0 min后差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);3組ALT和AST水平在再灌注60 min后都明顯升高，但參附組含量均明顯低于對照組和模型組(P＜0.05);再灌注180min后，3組ALT和AST水平仍然繼續(xù)升高，但參附組升高程度較低，且明顯低于對照組和模型組(P＜0.05)。

表1 各組大鼠再灌注后肝功能和TNF-α水平變化比較(X ±s，n=20)

2.3 血清TNF－α

結果見表1。再灌注0 min后，3組TNF-α含量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);再灌注60，180 min后，3組TNF-α含量不斷升高，但參附組含量明顯低于對照組和模型組組(P＜0.05)。

3 討論

肝移植大鼠門靜脈被阻斷，促使TNF-α表達，進而誘導黏附因子產生、補體激活、觸發(fā)中性粒細胞過氧化呼吸爆發(fā)等，是造成再灌注損傷的主要原因[5]。參附為中醫(yī)回陽救逆參附湯的中藥制劑，主要成分為人參皂苷和烏頭堿。研究證實，其基本藥理為增加冠狀動脈血流及血管灌注量、保護心肌、延長動物耐缺氧時間等。此外，人參皂苷能維持腦細胞能量代謝、改善腦內血流、增加缺血側腦內三磷酸腺苷含量，并能阻止細胞鈣通道，防止鈣超載，減輕腦內鈣離子積聚，抑制或減輕細胞結構的破壞[6-7]。

本試驗通過參附預處理供肝，建立大鼠肝移植缺血-再灌注模型，觀察其對移植肝臟的保護作用。結果表明，術后0 min，參附并未發(fā)揮有效作用;術后60 min和180 min，參附組ALT和AST含量明顯低于對照組和模型組，且肝組織病理學改變較輕。ELISA檢測血清TNF-α結果表明，術后60 min和180 min，雖然TNF-α的表達量不斷升高，但參附組明顯低于對照組和模型組，表明參附的作用機制在于降低了TNF-α的表達。

TNF-α可通過誘導黏附因子產生、補體激活、觸發(fā)中性粒細胞過氧化呼吸瀑布式反應等，是造成缺血-再灌注損害的關鍵細胞因子[8]。本試驗證明，參附對缺血-再灌注肝臟有明顯保護作用，為臨床預防肝移植術后的肝功能不全、肝切除術后肝功能損害提供了一個新的研究方向。

[1]Sturm E，Havinga R，Bailer JF，et al.Kupffer cell depletion with liposomal clodronate prevents suppression of Ntcp expression in endotoxin-treated rats[J].JHepatol，2005，42(1):102-109.

[2]徐光佑，謝 勇，藺曉源，等.超微參附湯對急性心肌缺血大鼠的保護作用[J].吉林中醫(yī)藥，2010，30(7):633-635.

[3]張義彬，涂 兵，龔建平，等.參附注射液對大鼠移植肝臟缺血再灌注損傷的保護作用[J].重慶醫(yī)科大學學報，2008，33(4):428-431.

[4]Peng Y，Gong JP，Liu CA，et al.Expression of toll-like receptor 4 and MD-2 gene and protein in Kupffer cells after ischemia-reperfusion in rat liver graft[J].World JGastroenterology，2004，10(9):2 890-2 893.

[5]劉作金，李生偉，游海波，等.內毒素預處理誘導大鼠供肝缺血再灌注交叉耐受機制的研究[J].中華實驗外科雜志，2005，22(11):1 335-1 337.

[6]秦 丹，劉先義.參附注射液對大鼠小腸缺血-再灌注后腎損傷的影響[J].醫(yī)藥導報，2011，30(4):440-442.

[7]霍根紅，李玉賢.參附強心膠囊對充血性心力衰竭大鼠心肌纖維化的影響[J].中醫(yī)學報，2011，26(3):322-323.

[8]Liu ZJ，Li XL，Zhao J，et al.The effects of SOCS-1 on liver endotoxin tolerance NF-KB-mediated pathway[J].Dig Liver Dis，2008，40(7):568-577.