饒春燕 付蘭英 趙曉晏

硫化氫對(duì)急性壞死性胰腺炎及相關(guān)肺損傷作用的初步探討

饒春燕 付蘭英 趙曉晏

硫化氫(H2S)是一種小分子質(zhì)量脂溶性氣體分子，可以自由滲透入細(xì)胞膜發(fā)揮生物效應(yīng)。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，以L-半胱氨酸為底物，通過激活5′-磷酸吡哆醛依賴性酶-胱硫醚-γ裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE，EC 4.4.1.1)和胱硫醚-β合成酶(cystathionine β-synthase, CBS，EC 4.2.1.22)生成H2S[1]。H2S在體內(nèi)主要有2 種存在形式，約1/3以氣體H2S形式存在，約2/3以NaHS (HS-)形式存在。大量證據(jù)顯示[1-2]，H2S在調(diào)節(jié)血管、胃腸道、心肌收縮、神經(jīng)傳遞和胰島素分泌等方面起著重要的作用。本研究用炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine, PAG)抑制內(nèi)源性H2S產(chǎn)生及給予外源性H2S載體(NaHS)，觀察其對(duì)急性壞死性胰腺炎(ANP)胰腺及肺炎癥浸潤的影響，并探討其機(jī)制。

一、材料與方法

1．大鼠模型建立及分組：66只6周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重202～243 g。按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組(6只)、ANP組(10只)、PAG組(10只)及5、10、20、100 mg NaHS組(均10只)。參照賴銘裕等[3]方法，采用經(jīng)腹腔注射6%左旋精氨酸溶液制備ANP模型。PAG組于建模前1 h經(jīng)腹腔注射PAG 50 mg/kg體重，各NaHS組于建模前1 h經(jīng)腹腔分別注射NaHS 5、10、20、100 mg/kg體重[4]。對(duì)照組以生理鹽水代替左旋精氨酸。左旋精氨酸購自上海生物有限公司，PAG、NaHS購自Sigma公司。建模24 h后取血，取胰尾部及右肺下葉外1/3組織置3.7%甲醛溶液固定，其余胰及肺組織立即凍存于液氮。

2．血淀粉酶、IL-6、H2S的測定：采用自動(dòng)生化儀檢測血清淀粉酶活性，采用ELASA法檢測血IL-6水平。H2S的檢測參考文獻(xiàn)[5]，先在試管中加入0.5 ml 10 g/L醋酸鋅,然后加入0.1 ml血漿標(biāo)本,振蕩混勻,再依次加入0.5 ml 20 mmol/L對(duì)氨基二甲基苯胺鹽酸鹽和0.5 ml 30 mmol/L三氯醋酸,再加入2.5 ml蒸餾水補(bǔ)足體積至5 ml,充分混勻，6000 r/min離心5 min,取上清液,用分光光度計(jì)在670 nm處檢測吸光值(A670值)。根據(jù)H2S標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液中H2S的含量。

3．胰腺及肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性檢測：將液氮凍存胰腺組織剪成小塊，稱重，加入9倍量的生理鹽水置Dounce勻漿機(jī)，制成10%胰腺組織勻漿，按照MPO檢測試劑盒(南京建成生物有限公司)說明書檢測MPO活性。

4．胰腺及肺組織CSE mRNA表達(dá)檢測：使用Trizol法提取胰腺及肺組織總RNA，應(yīng)用cDNA合成盒(Fermentas公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列：CSE-F 5′-TGGGACCAGAGCCGGAGCAA-3′，CSE-R 5′-AAGGCCCCGAGC-GAAGGTCA-3′；內(nèi)參GAPDH-F 5′-CTCATGACCACAGTCCATGC-3′，GAPDH-R 5′-TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3′，引物由湖南遠(yuǎn)泰生物技術(shù)公司合成。于 ABI PCR Thermal Cycler實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR，擴(kuò)增條件：95℃ 20 s，55℃ 20 s、72℃ 20 s，實(shí)時(shí)監(jiān)測記錄熒光強(qiáng)度，擴(kuò)增完畢后進(jìn)行熔解曲線分析。

二、結(jié)果

1．胰腺、肺組織學(xué)改變：對(duì)照組胰腺及肺臟無明顯改變。ANP組胰腺葉、小葉間隔距離增寬，散在多發(fā)壞死灶，伴炎性細(xì)胞浸潤，血管充血擴(kuò)張；肺泡壁嚴(yán)重破壞，彌漫性充血，肺間質(zhì)水腫，肺泡間隔增寬，大量中性粒細(xì)胞浸潤。PAG組胰腺腺泡細(xì)胞片狀出血、壞死，炎癥細(xì)胞大量浸潤，血管明顯充血；肺間質(zhì)大量中性粒細(xì)胞浸潤，小支氣管破壞嚴(yán)重，肺泡腔內(nèi)大量紅細(xì)胞。5 mg NaHS組病理改變與ANP組相似，隨NaHS濃度增加，胰腺腺泡細(xì)胞壞死程度逐漸減輕，肺內(nèi)出血量逐漸減少，炎性浸潤逐漸較少(圖1、2)。

圖1對(duì)照組(a)、ANP組(b)、PAG組(c)及10、20、100 mg NaHS組(d、e、f)胰腺病理改變(×200)

圖2對(duì)照組(a)、ANP組(b)、PAG組(c)及10、20、100 mg NaHS組(d、e、f)肺組織病理改變(×200)

2．血淀粉酶、IL-6、H2S水平的變化：ANP組血淀粉酶及IL-6水平均較對(duì)照組顯著升高，H2S水平較對(duì)照組顯著降低(P<0.01)。PAG組血淀粉酶及IL-6水平較ANP組進(jìn)一步升高，H2S水平較ANP組進(jìn)一步降低(P<0.01)。NaHS組血淀粉酶及IL-6水平隨NaHS濃度升高逐漸降低，直至與對(duì)照組無顯著差異；H2S濃度隨NaHS濃度升高而升高，但仍顯著低于對(duì)照組(P<0.01，表1)。

3．胰腺和肺組織MPO活性：ANP組胰腺和肺MPO活性均較對(duì)照組顯著升高，PAG組的MPO活性又較ANP進(jìn)一步升高(P值均<0.01)。NaHS組胰腺和肺MPO活性隨NaHS濃度升高逐漸降低，但仍顯著高于對(duì)照組(P<0.01，表1)。

4．胰腺和肺組織CSE mRNA表達(dá)水平：ANP組胰腺和肺組織CSE mRNA水平較對(duì)照組明顯降低，PAG組胰腺CSE mRNA表達(dá)較ANP組進(jìn)一步降低(P<0.01)，而肺組織CSE mRNA表達(dá)與ANP組無顯著差異。NaHS組胰腺和肺組織CSE mRNA水平隨NaHS濃度升高逐漸升高，在100 mg NaHS組，胰腺CSE mRNA水平與對(duì)照組無明顯差異，但肺組織CSE mRNA水平仍顯著低于對(duì)照組(P<0.01,表1)。

討論文獻(xiàn)報(bào)道，H2S供體(NaHS)能抑制由阿司匹林引起的白細(xì)胞黏附及白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子LFA-1、ICAM-1表達(dá)上調(diào)[6]，能顯著減少中性粒細(xì)胞在肝、肺組織中的聚集[7]。Li等[8]通過尾靜脈注射油酸誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型，給予NaHS可增加PaO2，增加IL-10水平，降低肺濕干重比和多形核白細(xì)胞浸潤，減輕肺損傷程度；同時(shí)降低血漿和肺組織中IL-6和IL-8水平。Tripatara等[9]報(bào)道, 給予缺血再灌注損傷大鼠NaHS可明顯降低組織損傷程度，減少再灌注組織中MAPK磷酸化，降低caspase-3活化水平，下調(diào)Bcl-2和NF-κB依賴蛋白(iNOS、COX2、ICAM-1)的表達(dá)[9]，而PAG則能加劇上述反應(yīng)。Tamizhselvi等[10]用雨蛙肽體外孵育胰腺腺泡細(xì)胞, 結(jié)果顯示蛋白激酶B(AKT)磷酸化減少、IκBα降解增加、NF-κB活性、TNF-α和IL-1β表達(dá)均升高；同時(shí)加入NaHS，則胰腺腺泡細(xì)胞的AKT磷酸化增加、IκBα降解減少、NF-κB活性及TNF-α、IL-1β表達(dá)均降低。

表1 各組血清淀粉酶、血漿H2S濃度、IL-6水平及胰腺和肺組織MPO活性、CSE mRNA表達(dá)

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；bP<0.01；與ANP組比較，cP<0.05，dP<0.01

本結(jié)果顯示，誘發(fā)ANP后，大鼠血H2S濃度明顯下降，胰腺和肺組織CSE mRNA表達(dá)下調(diào)。給予CSE抑制劑PAG抑制內(nèi)源性H2S生成后，胰腺和肺損傷及炎癥浸潤程度進(jìn)一步加重；給予外源性H2S(NaHS)后，H2S濃度升高，胰腺和肺組織CSE mRNA表達(dá)上調(diào)，胰腺和肺損傷程度減輕，提示CSE/H2S體系的下調(diào)參與ANP 的發(fā)病過程。

IL-6是一種重要的急性反應(yīng)期炎癥介質(zhì)，血IL-6水平有助于早期判斷急性胰腺炎病情的嚴(yán)重程度[11]。本結(jié)果顯示，ANP大鼠血漿IL-6水平明顯升高，給予PAG后進(jìn)一步升高，而給予NaHS后IL-6水平逐漸下降，表明H2S可以通過抑制IL-6的產(chǎn)生減輕ANP炎癥損傷程度，但其作用有限。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.018

400037 重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院消化內(nèi)科

趙曉晏，Email：zhaoxx@medmail.com.cn

2011-03-21)

(本文編輯：屠振興)