倪兆林，申元英，，白 麗，陳紅云，2，李潤兵

（1.大理學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

云龍黑木耳中多糖的提取與測定

倪兆林1，申元英1，2*，白 麗2*，陳紅云1，2，李潤兵1

（1.大理學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：提取云龍野生和人工培養(yǎng)兩種黑木耳多糖并測定其含量。方法：采用乙醇浸提法提取多糖，紫外分光光度苯酚-硫酸顯色法測定粗多糖含量。結(jié)果：在8.0～48.0 μg/mL線性范圍內(nèi)，回收率為99.03%，RSD為0.66%（n=6），測到野生和人工培養(yǎng)黑木耳中多糖的收率分別為18.48%和18.29%；野生和人工培養(yǎng)黑木耳中多糖的含量分別為9.21%和8.20%。結(jié)論：野生黑木耳比人工培養(yǎng)黑木耳中多糖的含量高，生長環(huán)境對黑木耳多糖含量有影響。

黑木耳；乙醇浸提法；紫外分光光度苯酚-硫酸顯色法；多糖；含量

黑木耳（Auricularia auricular）屬大型真菌，味干、平、無毒，具有益氣潤肺、涼血、止痛、補(bǔ)血、舒筋活絡(luò)等功效，是優(yōu)良的食用菌和藥用菌〔1〕。云龍黑木耳具有瓣大、朵型好、肉厚細(xì)嫩、色澤烏黑透亮、富有彈性、味道鮮美等特點(diǎn)，被譽(yù)為山珍中的“素中之葷”。木耳多糖可降低血脂、膽固醇和血糖含量，具有抗炎、抗腫瘤、抗凝血、抗動脈粥樣硬化、抗放射、抗血栓形成等作用〔2-4〕，還可增強(qiáng)人體超氧化物歧化酶（SOD）活力，減少自由基產(chǎn)生，提高免疫力，改善心肌缺氧。文獻(xiàn)〔10-11〕報道野生黑木耳的多糖含量比栽培黑木耳高2.69%。本文以云南省大理州云龍縣產(chǎn)的野生黑木耳和人工栽培黑木耳為材料，采用乙醇浸提法〔1，5-6〕提取多糖，紫外分光光度苯酚-硫酸顯色法測定粗多糖含量，旨在了解野生與人工栽培黑木耳之間的多糖含量區(qū)別，驗證前人結(jié)論。

1 試驗材料

1.1 樣品 野生黑木耳和人工培養(yǎng)黑木耳鮮品購于云南省大理州云龍縣市場，自然晾曬干燥備用。

1.2 試劑 石油醚、乙醇、氯仿、丙酮、濃硫酸（AR，天津市化學(xué)試劑三廠）；無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（AR，上海試劑廠）。

1.3 儀器設(shè)備 UV-T6紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器公司）；GZX-9240 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；電子恒溫水浴鍋（上海金橋科析儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 多糖的提取 準(zhǔn)確稱取10份干燥的黑木耳各10.00 g，分別經(jīng)石油醚60 mL于60℃回流脫脂2 h。傾去石油醚，剩余物揮干溶劑后分別用80%乙醇60 mL浸泡3 h，于80℃加熱1 h，過濾。將固體物分別用蒸餾水300 mL浸泡過夜，然后于90℃水中溫浸提取1 h，再用蒸餾水100 mL，于90℃重復(fù)溫浸提取30 min。過濾，合并濾液，減壓濃縮至30 mL，用氯仿萃取3次，以除去蛋白質(zhì)。過濾后，濾液加入95%乙醇使乙醇含量達(dá)80%，靜置過夜，多糖沉淀，過濾。濾餅依次用無水乙醇、丙酮、乙醚4次洗滌，干燥。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制 精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.000 0 mg，置250 mL容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，即可得到濃度為0.04 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.2 苯酚試液的配制 取苯酚100 g，加鋁片0.2 g、碳酸氫鈉0.1 g，蒸餾收集182℃的餾份，稱取此餾份10 g置棕色瓶中，加水150 mL，搖勻，備用。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別吸取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL的0.04 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液置于7個具塞試管中，分別加蒸餾水2.00、1.80、1.60、1.40、1.20、1.00、0.80 mL，使總體積為2.0 mL。再分別加苯酚試液1 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，迅速搖勻，靜置10 min，置沸水浴中加熱15 min后取出用冷水迅速冷卻至室溫。最后以第1管中未加入葡萄糖的作為空白對照。用紫外分光光度計于490 nm〔7〕的波長處檢測其吸光度。

2.3 樣品多糖含量的測定 精密稱取粗黑木耳多糖樣品粉末各0.300 0 g，置于燒瓶中，加80%乙醇100 mL，90℃回流提取1 h，趁熱過濾，濾餅用80%熱乙醇洗滌（10 mL×3）。濾餅連同濾紙置于燒瓶中，加蒸餾水100 mL，加熱至90℃提取2 h，趁熱過濾，濾餅用熱水洗滌（10 mL×3），洗液并入濾液，放冷后移入500 mL量瓶中，用蒸餾水定容成樣品備用。量取上述2種待測樣品溶液各0.50 mL，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線操作步驟和條件，測定吸光度。

3 結(jié)果與分析

試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進(jìn)行t檢驗分析。

3.1 黑木耳粗多糖及收率 樣品提取后干燥計算得野生和人工培養(yǎng)黑木耳的粗多糖收率平均為18.50%和18.30%，野生黑木耳收率高于人工培養(yǎng)黑木耳。兩種黑木耳的收率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 5.586，P=0.005）。見表1。

表1 黑木耳粗多糖及收率

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程建立 用紫外可見分光光度計，以未加入葡萄糖管作為空白對照，在490 nm的波長處測定吸光度，以吸光度值（A）對葡萄糖濃度C作回歸處理，得線性范圍為8.0～48.0 μg/mL，n=7的回歸方程。見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 換算因子的測定 精確稱取干操至恒重的精制黑木耳多糖4 mg，置于50 mL容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻。吸取上述溶液100 μL，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線操作方法操作測定吸光度，求出此精制黑木耳多糖中葡萄糖的濃度，按下式計算出換算因子F，F(xiàn)=W/（C×D）。式中：W為多糖重量（mg）；C為精制多糖中葡萄糖的濃度（μg/mL）；D為多糖的稀釋因素，經(jīng)計算得F=1.59。

3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一樣液適量，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線操作方法，測定吸光度，每隔0.5 h測定1次吸光度，連續(xù)測定6次，見表2。測定結(jié)果表明苯酚-硫酸顯色后，樣品溶液在在3 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.5 精密度試驗 取同一樣液適量，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線操作方法操作，重復(fù)測定吸光度5次。由實驗數(shù)據(jù)計算〔8〕得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.06%，小于5%，表明該方法精密度良好。

3.6 重復(fù)性實驗 重復(fù)吸取來自同一批原料的試樣，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線操作方法，分別測定其吸光度，檢驗該測定方法的重現(xiàn)性，由實驗數(shù)據(jù)計算得RSD為0.95%，小于5%，表明該方法重復(fù)性較好。

3.7 回收率試驗 取已提取的粗黑木耳多糖樣品溶液1.5 mL于6只試管中，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線操作方法，分別測定其吸光度，計算回收率，見表3，樣品回收率為99.83%，在97%～104%之間，RSD為0.96%小于5%，表明本法可行。

表3 回收率實驗結(jié)果

3.8 野生及人工培養(yǎng)黑木耳多糖的含量 按上述多糖含量測定方法，經(jīng)平行實驗操作3次，用回歸方程計算待測樣品溶液中葡萄糖的濃度：多糖含量（%）=（C×D×F/W）×100%

式中C為供試液葡萄糖濃度（μg/mL），D為供試液的稀釋因素，F(xiàn)為換算因子，W為供試品重量（μg），測定結(jié)果表明野生和人工培養(yǎng)黑木耳的粗多糖含量分別為9.21%和8.20%，野生黑木耳多糖含量高于人工培養(yǎng)黑木耳多糖含量。野生黑木耳與人工培養(yǎng)黑木耳多糖含量之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 5.078，P=0.007），結(jié)果見表4。

表4 野生及人工培養(yǎng)黑木耳中多糖含量

4 討論

目前，黑木耳的提取方法〔9〕有以下幾種：熱水浸提法，要求多次浸提，操作時間長，收率低；酸浸提法和堿浸提法，這兩種方法易使部分多糖發(fā)生水解，破壞多糖的活性結(jié)構(gòu)、減少多糖得率；酶價法，價格較高，使用的條件較為苛刻；超聲提取法，具有時間短、效率高、提取量高，可防止提取物在長時間、高溫條件下發(fā)生降解、褪色等變化；超聲波協(xié)同纖維素酶提取法，可達(dá)到加快細(xì)胞壁釋放多糖的速度，縮短提取時間、提高多糖提取率的目的；乙醇提取法，該方法簡單，顯色穩(wěn)定，靈敏度高，重現(xiàn)性好，適宜黑木耳多糖的含量測定。所以本試驗采用乙醇提取法。

據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道〔10〕野生黑木耳的蛋白質(zhì)、脂肪、總糖、多糖含量分別比栽培黑木耳高0.70%、0.06%、1.40%、2.69%。本試驗測得云龍縣野生黑木耳和人工培養(yǎng)黑木耳中多糖的含量分別為9.21%和8.20%，兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與上述結(jié)論相符。

志謝 感謝茍高章，陸鴛妮，曹艷芬，劉加梅等同學(xué)的支持與協(xié)助!

〔1〕韓春然，馬永強(qiáng)，唐娟.黑木耳多糖的提取及降血糖作用〔J〕.食品與生物技術(shù)學(xué)報，2006，25（5）:111-114.

〔2〕張潤光，刁小琴，關(guān)海寧.黑木耳營養(yǎng)保健功能及其產(chǎn)品開發(fā)〔J〕.保鮮與加工，2010，1（10）:54-56.

〔3〕劉雅靜，袁延強(qiáng)，劉秀河，等.黑木耳營養(yǎng)保健研究進(jìn)展〔J〕.中國食物與營養(yǎng)，2010，10（7）:6-68.

〔4〕李志強(qiáng)，鄭慧哲，劉鶴瑞，等.黑木耳多糖對兔動脈粥樣硬化斑塊中FAK表達(dá)的影響〔J〕.牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，32（1）:1-3.

〔5〕黃賢剛，全永亮，管斌，等.黑木耳多糖研究進(jìn)展〔J〕.糧油食品科技，2010，18（1）:46-49.

〔6〕王志剛，姜紅，朱蓓薇.堿法提取木耳渣中多糖的研究〔J〕.大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2007，26（3）:206-209.

〔7〕周玲，唐靜，李嬌，等.野生及人工培養(yǎng)香菇和黑木耳中粗多糖含量測定〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報，2008，7（8）:58-60.

〔8〕張?zhí)苽?，李天?苯酚-硫酸法測定西寧地區(qū)地木耳中多糖含量〔J〕.分析試驗室，2010，29（5）:219-220.

〔8〕郭平，盧家炯，林海霞.黑木耳多糖功效與提取方法〔J〕.中國林副特產(chǎn)，2006（6）:72-74.

〔9〕張鐘，高智謀，章戰(zhàn)華，等.野生黑木耳多糖的提取及特性研究〔J〕.中國食用菌，2006（25）:178-179.

〔10〕史岳紅，鮮喬，張擁軍.不同品種黑木耳多糖含量差異的研究〔J〕.浙江食用菌，2009，17（5）:15-17.

Extraction and Determination of Polysaccharides from Yunlong Auricularia auricular

NI Zhaolin1,SHEN Yuanying1，2*，BAI Li2*,CHEN Hongyun1，2，LI Runbing1
（1.Collegle of Public Health,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China; 2.Pre-clinical Collegle,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To extract both artificial culture and wild Auricularia auricular polysaccharides and determinate their contents.Methods:The polysaccharide wasextracted with ethanoland the polysaccharide contentwaswired by UV spectrophotometry phenol-sulfuric acid color method.Results:Within the range of 8.0-48.0 μg/mL,the recovery ratio of polysaccharide was 99.03%with RDS of 0.66%（n=6）.The recovery ratio of polysaccharide in artificial culture and wild Auricularia auricular were 18.48%and 18.29%,respectively.Artificial culture and wild Auricularia auricular in the polysaccharide content was 9.21%and 8.20%,respectively.Conclusion:Wild Auricularia auricular has higher content of polysaccharides than that of culture artificially.Growing environment affects the contents of Auricularia auricula's polysaccharides.

Auricularia auricula;ethanol extraction;UV spectrophotometry phenol-sulfuric acid method;polysaccharides;content

R284.2［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號］1672-2345（2012）03-0031-04

大理學(xué)院大學(xué)生科研基金資助項目（2008DXS131）

2011-06-15

2011-07-23

倪兆林，主要從事流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)研究.

*通信作者:申元英，教授；白麗，教授.

（責(zé)任編輯 毛本勇）