林春榕，潘 云，吳學東，曲文超，路會俠，莊立峰，劉慶文，盛 盼

（1.大理學院基礎醫(yī)學院，云南大理 671000；2.大理學院附屬醫(yī)院，云南大理 671000）

幼鼠小腸缺血-再灌注腸組織的形態(tài)學觀察

林春榕1，潘 云2，吳學東2，曲文超2，路會俠2，莊立峰2，劉慶文2，盛 盼2

（1.大理學院基礎醫(yī)學院，云南大理 671000；2.大理學院附屬醫(yī)院，云南大理 671000）

目的：觀察幼鼠小腸缺血-再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）腸組織形態(tài)學變化。方法：將32只4周齡（Sprague Dawley，SD）大鼠隨機分成2組即假手術組（Sham組）和缺血-再灌注組（I/R組），每組各16只。Sham組僅暴露腹腔臟器，不作任何干預；I/R組經阻斷腸系膜上動脈60 min后恢復血供，于再灌注30、60、90、120 min每組動物各處死4只取小腸組織進行組織學Chiu’s評分，結果進行單因素方差分析和組間t檢驗。結果：Sham組腸組織形態(tài)正常；I/R組小腸組織發(fā)生了明顯的缺血和炎癥反應并隨再灌注時間延長而加重，各觀察時間點組織學評分在組間比較差異均有統(tǒng)計學意義，各值在I/R組高于Sham組（P＜0.05）。結論：幼鼠腸I/R導致腸組織病理損傷并隨再灌注時間延長而加重。

腸缺血-再灌注損傷；腸組織；組織學；幼鼠

腸缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）是小兒常見的問題〔1-3〕，盡管由于各種原因導致腸I/R所導致的腸道損傷已被廣泛重視，但通常情況下難以獲得腸I/R后的組織標本進行研究，因而對小兒腸I/ R腸組織損傷的變化規(guī)律和轉歸認識尚少，本研究利用幼鼠造成腸I/R模型并動態(tài)觀察腸管I/R的后腸組織的形態(tài)學變化，以此闡述腸I/R對腸組織形態(tài)的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 4周齡健康（Sprague Dawley，SD）大鼠幼鼠共32只，雌雄不限，SPF級，動物編號：許可證SCXK（渝）2007-017，體重100±15 g。手術室溫度25～27℃，相對濕度50%～65%。

1.1.2 實驗試劑、器械、儀器 10%水合氯醛溶液（大理學院附屬醫(yī)院制劑室配制）；0.9%生理鹽水；常用消毒劑；小手術器械及手術用品。

BM-Ⅷ生物組織包埋及冷凍機（孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司），PHY-Ⅲ病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司），萊卡石蠟切片機（LE-ICARM2025型），OLYMPUSBX-41型多功能生物顯微鏡（日本奧林巴斯光學有限公司）和HMIAS-2000型高清晰醫(yī)學彩色圖象分析儀（武漢千屏影像公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 32只DS大鼠隨機分為假手術組（Sham組）和I/R組，每組16只。

1.2.2 動物實驗 用10%水合氯醛溶液腹腔內注射（3 mL/kg）麻醉后仰臥位固定，腹部去毛，消毒后取上腹正中縱行切口，依次切開入腹，尋找并游離腸系膜上動脈（superior mesenteric artery，SMA）根部，見圖1。用橡皮條阻斷腸系膜上動脈血流60 min，見圖2。松開橡皮條，恢復腸系膜血流，造成小腸缺血-再灌注模型。Sham組動物在開腹后不做任何干預于I/R組再灌注后30、60、90、120 min時4個時間點每組各處死動物4只，取距回盲瓣5 cm處近端2 cm長的小腸標本備做組織學研究。

圖1 尋及腸系膜上動脈

圖2 阻斷腸系膜上動脈血供

1.2.3 組織學觀察 所取小腸組織制成6～8 μm厚度的切片后進行H-E染色，光鏡下觀察腸粘膜的形態(tài)學變化，每張切片隨機選擇鏡下10視野（100×），腸粘膜損傷程度按Chiu氏6級評分法〔4-5〕進行組織病理評分：0級為正常腸粘膜絨毛結構，組織形態(tài)正常，記為0分；1級為腸粘膜絨毛頂端上皮下間隙增寬，腸壁組織水腫，記為1分；2級為絨毛上皮下間隙明顯增寬，絨毛上皮與固有膜剝脫，記為2分；3級為絨毛上皮成塊脫落，記為3分；4級為絨毛上皮完全脫落，固有膜結構裸露，記為4分；5級為固有膜結構崩解形成潰瘍并出血，記為5分。

1.3 統(tǒng)計學處理 用SPSS11.0整理數據。各組資料以均數±標準差（±s）表示，組間進行單因素方差分析和組間t檢驗，組內比較采用配對t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

本實驗共用動物32只，I/R組經夾閉腸系膜上動脈后相應腸系膜血管搏動消失，腸管顏色蒼白并逐漸轉變?yōu)榘底仙妶D3。缺血60 min后恢復血供，在再灌注后30 min腸管顏色逐漸恢復的同時逐漸出現腸壁充血水腫并不斷加重，至再灌注90 min時腸管呈現暗紫色形如缺血60 min時的改變，見圖4。繼之腸管顏色逐漸好轉，直至120 min時腸管色澤恢復但水腫仍然較為明顯。

圖3 小腸缺血再灌注模型

圖4 小腸缺血后再灌注90 min的腸管改變

2.1 組織學觀察結果 Sham組腸組織無水腫及出血，腸管各層及腸組織內各結構正常。見圖5。

I/R組在再灌注30 min的腸組織可見充血水腫，而在60 min及以后2個時間點出現小腸絨毛脫落和缺損、點狀出血和潰瘍形成、粘膜不同程度的絨毛排列紊亂和組織內炎性細胞浸潤，其中再灌注以90 min時最為明顯，呈現明顯的粘膜上皮脫落，潰瘍形成并出血，腸組織內炎性細胞浸潤和組織結構松散。見圖6。120 min時腸組織形態(tài)無明顯改善，但潰瘍和出血情況也無明顯加重。

圖5 正常腸粘膜（HE×100）Chiu氏評分0分

圖6 缺血再灌注組腸粘膜（HE×100）Chiu氏評分5分

2.2 腸粘膜損傷程度的Chiu氏6級評分 通過對小腸組織進行病理損傷的Chiu氏6級評分，獲得各組各時間點的平均分值。見表1。Sham組各時間點的評分值變化較小，而各時間點I/R組的評分值均較Sham組增高，并呈現逐漸增高的趨勢，其中以再灌注90 min時為最高，120 min時有所回降。

表1 各組各時間點小腸粘膜損傷病理Chiu氏評分結果

Chiu’s評分值在組間比較經單因素方差分析和組間各相應時間點評分值比較經t檢驗差異均有統(tǒng)計學意義，I/R組的評分明顯高于Sham組（P＜0.05）；在組內各時間點Chiu’s評分值比較，Sham組各時間點測得值間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而在I/R組內比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但僅在60、90和120 min時的評分高于30 min時的評分值，而評分值在60、90、120 min 3個時間點間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

腸I/R是常見的臨床問題，也是小兒外科常見的臨床現象。腸扭轉、嵌頓疝、腸套疊、粘連帶壓迫、腸內糞石或蛔蟲團塊等多種原因所致腸梗阻和小腸移植、失血性休克等均造成腸缺血，在腸梗阻整復和、休克復蘇后使腸管血供恢復即形成腸I/R。腸缺血將造成不同程度的組織損傷，而再灌注后腸組織在原缺血造成損傷的基礎上組織損傷將進一步加重，則形成再灌注損傷。腸道的血供豐富因而對缺血缺氧十分敏感，是再灌注損傷時最易受累的器官之一，然而腸道又是大量細菌及其代謝產物內毒素的貯存場所，腸I/R不僅可導致腸道損傷還可導致遠隔器官的損傷，甚至發(fā)生多系統(tǒng)和器官功能衰竭〔6-7〕。因此，進行腸I/R腸組織形態(tài)學研究對進一步研究和認識小兒腸I/R損傷及其發(fā)生機制有重要的意義。

本實驗利用幼鼠制作腸I/R模型，在結扎腸系膜上動脈阻斷小腸血供1 h后恢復血流灌注，腸管色澤好轉，但再灌注90 min時腸管再度呈現缺血的改變；在再灌注的120 min觀察期內，腸管水腫進行性加重，而Sham組腸管外觀無明顯變化。組織學上呈現缺血和炎癥的改變并隨再灌注時間延長而加重，其中以再灌注90 min時改變最為明顯，對組織學損傷程度的Chiu氏評分結果與腸管大體和鏡下改變相吻合。實驗結果表明，幼鼠小腸缺血1 h恢復血供后，腸組織缺血的狀況并不隨著血供恢復而迅速改善，而是呈現缺血的后果—壞死逐漸變得明顯，隨著再灌注時間延長出現粘膜點狀出血和潰瘍形成；在再灌注過程中，腸組織發(fā)生了炎癥反應，出現組織充血、水腫、滲出、壞死和炎性細胞浸潤的病理過程。如果說缺血的改變源于腸系膜血供的中斷，并在再灌注過程中逐漸表現出來，而組織壞死脫落需要時間，因而表現為再灌注過程中缺血的改變逐漸加重，那么炎癥反應則是在缺血基礎上組織發(fā)動的另一病理過程，這一過程造成了新的更嚴重的變化，表現為腸管缺血—好轉—再缺血—最終好轉。出現再缺血的現象可能歸結于“無復流現象（no-reflow phenomenon）”〔7〕。

本實驗觀察再灌注時間雖較短，但卻發(fā)生了腸組織形態(tài)的轉折性變化，這可能與動物年齡和處理因素有關。由于幼年動物機體的防御機制發(fā)育并不完善，且組織中水的含量大于成年動物，加之幼年動物的修復能力較強，一旦有損傷因素存在組織將發(fā)生快速而明顯的反應，而一旦損傷因素去除，修復也比較快。有對肝臟I/R損傷的研究表明，幼年動物的病理改變較成年動物的改變輕〔8〕。本實驗僅阻斷幼鼠小腸動脈血供，而在臨床各種原因導致小兒腸I/R損傷往往都是先發(fā)生靜脈回流障礙，繼之動脈血供中斷，患兒腸管的病理變化應該更為明顯而且病理過程更長。有學者通過動物實驗觀察到，在相同的觀察時間內，不同的處理因素獲得的病理改變程度也不一致，其中阻斷動脈血供的病理改變較阻斷靜脈或動靜脈同時阻斷的變化要輕〔9〕?；谝陨显颍诒緦嶒炗^察到再灌注過程中幼鼠腸管出現一過性再缺血的現象。

研究表明，幼鼠腸I/R導致腸組織缺血性損傷的同時發(fā)生了炎癥反應并隨再灌注時間延長而加重，但其機制尚未完全明了，有待進一步研究。

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Histological Study of Intestine with Ischemia/Reperfusion Injury in Young Rats

LIN Chunrong1,PAN Yun2,WU Xuedong2,QU Wenchao2,LU Huixia2,ZHUANG Lifeng2,LIU Qingwen2，SHENG Pan2
（1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China；2.Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To explore the intestinal histological changes of intestinal ischemic/reperfusion（I/R）injury in young rats. Methods:32 Sprague Dawley（SD）rats at 4 weeks old were divided into 2 groups with 16 in each group randomly,and there were sham operated group as a control and I/R group.The abdominal cavity were exposed in all rats but not any intervene in sham group, the superior mesenteric artery were occluded in I/R group for 60 min and followed by 30 min,60 min,90 min and 120 min for reperfusion and 4 rats were harvested at each time point.The intestine specimens were obtained for pathological study and determination of histopathologic score.The data were analyzed statistically.Results:There were pathological changes of ischemia and inflammatory obviously and getting severer with the reperfusion time prolong in all rats but in the sham group.There was statistical significance as a result of the Chiu's score between two groups in every time point（P＜0.05）.The scores in I/R group were higher than that in sham group（P＜0.05）.The score was highest at 90min among four time points in each I/R group.Conclusion:The pathological changes of intestinal injury caused by I/R were getting severer with reperfusion prolong.

intestinal ischemia-reperfusion injury；intestine；histology；young rat

Q463［文獻標志碼］A［文章編號］1672-2345（2012）03-0024-04

云南省自然科學基金資助項目（2009ZC121M）

2011-12-31

2012-03-06

林春榕，副教授，主要從事生物化學與分子生物學研究.

（責任編輯 董 杰）