王文磊，魯永強(qiáng)，蘇東海，武建新

（1.包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014035；2.北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京100029）

蒙古奶酪凝塊中酵母菌的分離鑒定

王文磊1，魯永強(qiáng)1，蘇東海2，武建新1

（1.包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014035；2.北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京100029）

從蒙古奶酪凝塊中分離檢定酵母菌，既可保護(hù)內(nèi)蒙古草原原始微生物資源，同時(shí)為奶酪的工業(yè)化生產(chǎn)培養(yǎng)國(guó)產(chǎn)菌種。從蒙古奶酪凝塊中使用經(jīng)典酵母菌分離鑒定方法得到12株酵母菌，經(jīng)鑒定分別是4株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），3株馬克斯克魯維酵母 （Kluyveromyces marxianus），2株班圖酒香酵母（Brettanomyces custersianus），3株膜醭畢赤氏酵母（Pichia membranaefacienf）。

蒙古奶酪，酵母菌，分離，鑒定

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2%美蘭染色液，5%孔雀綠水溶液，0.5%兼性藏紅花；林格氏碘液 碘5g，碘化鉀10g，蒸餾水100mL；甲液 對(duì)氨基苯磺酸0.8g，5mol/L醋酸溶液100mL；乙液 ɑ-萘胺0.5g，5mol/L醋酸溶液100mL；重氮基藍(lán)液B液 0.1mol/L三羥輕甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH7.0，每毫升含1mg；麥芽汁培養(yǎng)基（1號(hào)培養(yǎng)基）

麥芽汁300mL，酵母膏3g，蛋白胨5g，乳糖10g，瓊脂20g，蒸餾水700mL，pH6.0；馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA） 馬鈴薯20g，葡萄糖2g，瓊脂1.5～2g，蒸餾水100mL，自然pH；Gorodkowa瓊脂培養(yǎng)基 葡萄糖1g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL；麥芽汁-酵母膏-葡萄糖-蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基 干麥芽粉3g，干酵母粉3g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，蒸餾水1000mL，制成液體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基加瓊脂20g；玉米粉瓊脂培養(yǎng)基[2]黃玉米粉12.5g，蒸餾水300mL，攪勻置60℃維持1h，過濾，濾液的體積為300mL，加3.8g瓊脂；McClary醋酸瓊脂培養(yǎng)基 葡萄糖0.1%，KCl 0.18%，酵母浸粉0.25%，三水醋酸鈉0.28%，瓊脂1.5%，蒸餾水1000mL；糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)液 按照參考文獻(xiàn)[3]中配置；硝酸鹽培養(yǎng)基 硝酸鉀0.2g，蛋白胨5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.4。以上培養(yǎng)基在使用前需經(jīng)過高壓蒸汽滅菌，121℃，15min；實(shí)驗(yàn)樣品 從內(nèi)蒙古牧區(qū)采樣點(diǎn)收集的蒙古奶酪凝塊共5份。采樣時(shí)，采集發(fā)酵結(jié)束煮熬之前的凝塊（半成品），迅速放入事先準(zhǔn)備好的無(wú)菌瓶中密封，置4℃冰柜中備用。

超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱（溫度范圍20～100℃）、高速冷凍離心機(jī)（TGL-16G-A） 上海精密儀器儀表有限公司；普通光學(xué)顯微鏡OLYMPUS-CO11 日本奧林巴斯公司。

表1 采樣及編號(hào)Table 1 Sample and number

1.2 酵母菌鑒定

圖1 酵母菌鑒定程序[6]Fig.1 Yeast identification program

1.2.1 酵母菌的分離純化 菌種的分離進(jìn)行了兩次，一次在取樣現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行，培養(yǎng)溫度選用當(dāng)?shù)禺?dāng)時(shí)室內(nèi)溫度。另一次將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行無(wú)菌操作。用接種環(huán)分別挑取樣品用劃線的方式接種于1號(hào)麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度選擇15、20、25、30℃四個(gè)溫度梯度（涵蓋了大多數(shù)酵母菌生長(zhǎng)的溫度范圍），培養(yǎng)時(shí)間1～3d。之后挑取酵母菌可疑菌落，美蘭染色30s后，顯微鏡觀察其形態(tài)，將確認(rèn)為酵母菌的菌落接種于1號(hào)培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。純化兩次后，菌種穿刺接種到1號(hào)半固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)36h后置于4℃冰箱備用。（如無(wú)特殊說(shuō)明，以下實(shí)驗(yàn)所用菌種均取自上述1號(hào)半固體培養(yǎng)基保存的菌種）。

1.2.2 酵母菌鑒定程序 根據(jù)巴尼特JA《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[2]，Kurtzman CP，F(xiàn)ell JW《The Yeasts，a Taxonomic Study》[4]，周德慶編《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》進(jìn)行鑒定[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離結(jié)果

從五個(gè)樣品中分別分離出12株酵母菌，如表2所示。其菌落形態(tài)如表3所示。

表2 分離酵母菌編號(hào)Table 2 Isolation of yeasts

表3 酵母菌落形態(tài)結(jié)果Table 3 Yeast colony morphology results

2.2 酵母菌屬的鑒定結(jié)果

表4 酵母菌細(xì)胞形態(tài)和繁殖方式Table 4 Yeast cell morphology and reproductive modes

酵母菌細(xì)胞形態(tài)和繁殖方式如表4所示。

分離出的12株酵母菌為圓形、橢圓形和小橢圓形，沒有臘腸形和瓜子形等長(zhǎng)形。有的有假菌絲，有的沒有，有的出現(xiàn)有隔菌絲。無(wú)性繁殖都為芽殖，除XB3和HX3外都產(chǎn)生子囊。12株酵母菌都沒有擲孢子出現(xiàn)。

XB1、XL1、HX2、EW2細(xì)胞形態(tài)為橢圓形或小橢圓形，可見假菌絲，但數(shù)量較少；無(wú)性繁殖為芽殖，有性繁殖產(chǎn)生子囊，并永久性存在，子囊中有1～7個(gè)子囊孢子，多見1～4個(gè)，孢子形狀圓形、橢圓形和卵圓形；無(wú)擲孢子產(chǎn)生；判斷為酵母屬。XB2、XL2、BS1細(xì)胞形態(tài)為圓形或橢圓形，少有假菌絲；無(wú)性繁殖為芽殖；有性繁殖產(chǎn)生子囊，子囊中有1～60個(gè)圓形或橢圓形子囊孢子，當(dāng)孢子成熟放出后，子囊即消失；無(wú)擲孢子產(chǎn)生；判斷為克魯維酵母屬。XB3、HX3均無(wú)子囊孢子，無(wú)擲孢子生成，無(wú)性繁殖為芽殖，有時(shí)有假菌絲，細(xì)菌形態(tài)橢圓形或小橢圓形；屬于酒香酵母屬。EW1、HX1、BS2均為橢圓形，產(chǎn)生假菌絲；產(chǎn)生子囊，子囊孢子1～8個(gè)禮帽形、土星形；無(wú)擲孢子；屬于畢赤氏酵母屬。

2.3 酵母菌種的鑒定結(jié)果

酵母菌生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

以下鑒定基于巴尼特J A《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[2]，《The Yeasts，a Taxonomic Study》第四版[7]，KurtzmanCP，F(xiàn)ellJW《TheYeasts，aTaxonomicStudy》[4]提供的鑒定依據(jù)進(jìn)行。

表5 酵母菌糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Experiment results of yeast fermentation

表6 酵母菌碳同化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Experiment results of yeast carbon assimilation

表7 酵母菌氮同化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Experiment results of yeast nitrogen assimilation

觀察生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有待測(cè)菌株在硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、類淀粉物質(zhì)生成實(shí)驗(yàn)、脲酶實(shí)驗(yàn)和DBB實(shí)驗(yàn)中都為陰性反應(yīng)。XB1、XL1、HX2和EW2四株菌全部發(fā)酵葡萄糖和半乳糖，不發(fā)酵乳糖和纖維二糖，部分發(fā)酵蔗糖、麥芽糖、棉籽糖。不同化密二糖、D-阿拉伯糖、赤蘚糖、甘露醇、肌醇、檸檬酸，部分同化可溶性淀粉、乙醇、琥珀酸和乳酸。在單一氮源培養(yǎng)基中不同化硝酸鹽、尸胺和亞硝酸鹽，部分同化賴氨酸。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)和繁殖方式的鑒定結(jié)果，判斷為酵母屬的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

XB2、XL2、BS1幾乎可發(fā)酵所有被檢糖。在碳同化實(shí)驗(yàn)中，在密二糖、可溶性淀粉、D-阿拉伯糖、赤蘚糖和肌醇中不生長(zhǎng)，在甘露醇和檸檬酸中部分生長(zhǎng)，在乙醇、琥珀酸和乳酸中全部生長(zhǎng)。結(jié)合細(xì)菌形態(tài)和繁殖方式的鑒定結(jié)果，判斷為克魯維酵母屬的馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）。

XB3、HX3幾乎不發(fā)酵所有被檢糖，只有D-葡萄糖經(jīng)過延期1周后發(fā)酵。在碳同化實(shí)驗(yàn)中，也表現(xiàn)冷淡，大部分碳水化合物不生長(zhǎng)，只有乙醇全部生長(zhǎng)，琥珀酸和乳酸部分生長(zhǎng)。在單一氮源培養(yǎng)基中硝酸鹽和亞硝酸鹽氮源不生長(zhǎng)，在尸胺和賴氨酸中部分生長(zhǎng)。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)和繁殖方式的鑒定結(jié)果，判斷為酒香酵母屬的班圖酒香酵母（Brettanomyces custersianus）。

EW1、HX1、BS2三株菌在發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中除D-葡萄糖部分發(fā)酵外不發(fā)酵其他被檢糖。在碳源同化實(shí)驗(yàn)中可同化乙醇，在琥珀酸和乳酸中部分生長(zhǎng)，其他被檢碳水化合物均不生長(zhǎng)。氮源同化實(shí)驗(yàn)中，在含尸胺和賴氨酸培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)，硝酸鹽和亞硝酸鹽培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。另外，這三株菌的液體培養(yǎng)基發(fā)酵液表面形成膜醭，發(fā)酵液渾濁，菌體聚集在試管底部，只要輕輕振蕩就會(huì)快速漂起。而其他的液體培養(yǎng)基發(fā)酵液都沒有形成膜醭，發(fā)酵液清澈，菌體沉淀在底部，劇烈搖動(dòng)才能將菌體浮起并迅速落下。再結(jié)合細(xì)胞形態(tài)和繁殖方式的鑒定結(jié)果，判斷為畢赤氏酵母屬的膜醭畢赤氏酵母（Pichia membranaefacienf）。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從內(nèi)蒙古錫林郭勒盟、鄂爾多斯市、呼和浩特市和包頭市周邊草原收集蒙古奶酪發(fā)酵液5份，覆蓋了內(nèi)蒙古中、東部地區(qū)，采樣范圍具有代表性。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，得出以下結(jié)論：從蒙古奶酪凝塊中得到12株酵母菌，經(jīng)鑒定分別是4株釀酒酵母，3株馬克斯克魯維酵母，2株班圖酒香酵母，3株膜醭畢赤氏酵母。

[1]梁茂文.酵母菌在低酒精度乳制品生產(chǎn)及養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（2）：67-71.

[2]巴尼特J A.酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)[M].胡瑞卿譯.青島：青島海洋大學(xué)出版社，1990.

[3]倪慧娟.新疆地區(qū)和青海地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中酵母菌的生物多樣性[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[4]Kurtzman C P，F(xiàn)ell J W.The yeasts，a taxonomic study[M]. 4th edn.Amsterdam：Elsevier，Science B V，Amsterdam，1998.

[5]周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1992.

[6]張積榮.酸馬奶中酵母菌的分離鑒定及發(fā)酵過程中乙醇含量變化的研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[7]Elsevier.Theyeasts，ataxonomicstudy[M].4thedn.Amsterdam：Elsevier，Science B V，Amsterdam，1998：360-367.

Isolation and identification of yeast in the Mongolian cheese clots

WANG Wen-lei1，LU Yong-qiang1，SU Dong-hai2，WU Jian-xin1
（1.Baotou Light Industry Vocational Technical College，Baotou 014035，China；2.Beijing Vocational College of Electronic Science and Technology，Beijing 100029，China）

Clot test yeast were isolated from Mongolian cheese.It can protect the original microbial resources in Inner Mongolia grassland，and train cheese bacteria for domestic industrial production.Using the classic method isolation and identification of yeasts cheese clot from Mongolia to get 12 yeasts，which was identified four Saccharomyces cerevisiae，three Max Kluyveromyces，two Brettanomyces custersianus and three Pichia membranaefacienf respectively.

Mongolian cheese；yeast；separation；identification

TS201.2

A

1002-0306（2012）03-0149-04

蒙古奶酪是一種傳統(tǒng)的民族食品，是具有牧區(qū)特點(diǎn)的牧民非常喜歡的直接入口食品。其加工工藝如下：牛奶、馬奶或羊奶等哺乳動(dòng)物鮮奶→倒入攪乳桶不斷攪拌提取奶油→桶中剩余脫脂乳放置于溫度較高處（一般25～35℃）自然發(fā)酵3～5d→當(dāng)桶中脫脂乳變酸后，倒入鍋中煮熬，待酸奶呈現(xiàn)出豆腐形狀時(shí)稱為奶渣，將奶渣舀進(jìn)紗布里擠壓除去水份→把奶渣放進(jìn)模具或木盤中擠壓成形→根據(jù)喜好進(jìn)行晾曬控制水分含量（也可不進(jìn)行晾曬直接食用）→成品奶酪。蒙古奶酪制作過程使用內(nèi)蒙古草原上的天然微生物自然發(fā)酵，是我國(guó)本土微生物的絕好來(lái)源。酵母菌在蒙古奶酪發(fā)酵過程中起著不可忽略的作用，尤其對(duì)于奶酪風(fēng)味物質(zhì)的生成貢獻(xiàn)突出。酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)主要有乙醇、酸類以及其他醇類物質(zhì)，形成特有的酒花香味，既增加蒙古奶酪的凝固性，又有助于食物消化。同時(shí)酵母菌能夠產(chǎn)生多種水溶性維生素，進(jìn)一步提高了蒙古奶酪的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。在發(fā)酵過程中，酵母菌和乳酸菌共同作用分解乳蛋白，降解乳糖生成氨基酸、乳酸、乙醇、有機(jī)酸和其他風(fēng)味成分，賦予蒙古奶酪乳香、醇香的特點(diǎn)。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)具有以下意義：保護(hù)來(lái)自內(nèi)蒙古草原的微生物資源；為奶酪加工用菌種完全國(guó)產(chǎn)化提供前提。

2011－03－15

王文磊（1978-），女，碩士，工程師，講師，研究方向：發(fā)酵乳制品。

生物技術(shù)在奶制品加工中的應(yīng)用（PXM2011_014306_113565）。