秦佳麗，曹婷婷,，孫敬帥，周 健，李智麗，高彬文，趙云翔,*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528000；2.廣西揚(yáng)翔股份有限公司，廣西貴港 537000；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州 450000）

評(píng)價(jià)公豬精液品質(zhì)的指標(biāo)包括精液活力、前向運(yùn)動(dòng)、畸形率等，這些指標(biāo)與公豬的繁殖性能緊密相關(guān)。精子周?chē)沫h(huán)境和物質(zhì)容易對(duì)精液保存質(zhì)量產(chǎn)生較大影響，例如采精環(huán)境的衛(wèi)生程度、采精流程是否達(dá)到無(wú)菌標(biāo)準(zhǔn)等都是決定精液質(zhì)量的關(guān)鍵因素。此外，研究表明在精液中添加一些外源性抗氧化物質(zhì)如白藜蘆醇、褪黑素能夠顯著避免精子損傷，提高精子的運(yùn)動(dòng)能力和受精能力。但同時(shí)精液中存在的細(xì)菌等不良物質(zhì)會(huì)造成精子凝集，嚴(yán)重?fù)p害精液質(zhì)量。因此精子生存環(huán)境的研究對(duì)于完善公豬精液體外保存方法，提高公豬繁殖力具有重要意義。

目前在杜洛克精液中觀察到微凝塊存在，生產(chǎn)中往往將其視為精液中的雜質(zhì)，并使用多層精液專(zhuān)用濾膜對(duì)含凝塊較多的精液過(guò)濾，以避免可能帶來(lái)的負(fù)面影響。但該凝塊物在精液保存中的實(shí)際影響尚不清楚，故本文旨在探究杜洛克公豬精液中該凝塊物存在對(duì)于精液保存中活力、前向運(yùn)動(dòng)能力、畸形率的影響，提供理論參考用以指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 計(jì)算機(jī)輔助精子分析（Computer-Aided Sperm Analysis，CASA）系統(tǒng)（Hamilton Thorne IVOS II）、豬精稀釋粉（全能健Z，江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司）、17℃恒溫箱、精液濾紙。

1.2 樣品精液的采集 樣品采集自揚(yáng)翔某公豬站15 頭健康杜洛克公豬的單次射精，使用手握法采集后立即送至實(shí)驗(yàn)室處理，使用計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)對(duì)精液參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，活力>80 為合格。

1.3 精液處理方法 根據(jù)凝塊狀況將15 份精液分為無(wú)凝塊組（n=7）和凝塊組（n=8）。另取含凝塊的稀釋后精液經(jīng)常溫2 h 靜置，取3 層精液專(zhuān)用濾紙（100 μm）根據(jù)紋理層與層間垂直疊放過(guò)濾以模擬生產(chǎn)中除去凝塊的常規(guī)操作，設(shè)置為凝塊過(guò)濾組（n=8），所有樣品保存于17℃恒溫箱。稀釋調(diào)整精子密度為0.23 億/mL。

1.4 凝塊觀察方法 取精液樣品3 μL，加于八腔玻片，置于37℃加熱板上預(yù)熱2 min，使用CASA 系統(tǒng)鏡頭拍攝4 個(gè)視野對(duì)凝塊進(jìn)行形態(tài)和數(shù)量統(tǒng)計(jì)。隨機(jī)選取來(lái)自凝塊組8 個(gè)樣品采精當(dāng)天的圖像，Image J 測(cè)量共計(jì)111 個(gè)凝塊的最長(zhǎng)直徑；取凝塊組、過(guò)濾組各樣品4 個(gè)視野凝塊數(shù)量之和表示每個(gè)樣品的凝塊數(shù)量。

1.5 精液檢測(cè)方法 取精液樣品3 μL，于八腔玻片，置于37℃加熱板預(yù)熱2 min，使用CASA 系統(tǒng)取4 個(gè)視野進(jìn)行計(jì)算分析，記錄活力、前向運(yùn)動(dòng)、正常形態(tài)3 項(xiàng)指標(biāo)數(shù)值，其中畸形率計(jì)算公式為：畸形率=100-正常形態(tài)。以采精當(dāng)天記作第0 天，每24 h 檢測(cè)1 次，連續(xù)檢測(cè)8 d。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 本實(shí)驗(yàn)使用Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，通過(guò)IBM SPSS Statistics 26 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，過(guò)濾前后凝塊數(shù)量的差異分析使用配對(duì)檢驗(yàn)；精液質(zhì)量參數(shù)組間分析使用LSD 多重比較，時(shí)間點(diǎn)間以采精當(dāng)天（第0 天）作為對(duì)照組，使用Dunnet 雙側(cè)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。<0.05 表示差異顯著，>0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 凝塊的形態(tài)和數(shù)量 通過(guò)對(duì)圖像的觀察和測(cè)量，凝塊主要呈碎屑狀，其最長(zhǎng)直徑范圍為10～55 μm（圖1）。對(duì)采精當(dāng)天凝塊組、凝塊過(guò)濾組的凝塊數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示過(guò)濾后凝塊數(shù)量下降（<0.01）（圖2）。

圖1 精液中凝塊的形態(tài)與大小

圖2 凝塊組與凝塊過(guò)濾組的凝塊數(shù)量

2.2 凝塊對(duì)于杜洛克公豬精液活力的影響 由表1 可知，無(wú)凝塊組、凝塊組、凝塊過(guò)濾組在采精當(dāng)天的活力組間差異不顯著，但凝塊組精液活力在保存第5～7 天高于無(wú)凝塊組（<0.05），在保存第5～6 天高于凝塊過(guò)濾組（<0.01）。

表1 凝塊對(duì)于杜洛克公豬精液活力的影響 %

此外，相較于各組采精當(dāng)天的活力，無(wú)凝塊組下降趨勢(shì)最為明顯，在第5 天顯著下降，在第6、7 天具有極顯著下降趨勢(shì)；凝塊過(guò)濾組次之，凝塊組下降趨勢(shì)最小，僅在第7 天具有顯著下降趨勢(shì)。

2.3 凝塊對(duì)于杜洛克公豬精液前向運(yùn)動(dòng)的影響 由表2可知，在采精當(dāng)天以及保存前3 d，無(wú)凝塊組前向運(yùn)動(dòng)能力最佳；而在保存第4～7 天，凝塊組的前向運(yùn)動(dòng)能力最佳，且顯著高于過(guò)濾組。除第2 天外，凝塊過(guò)濾組前向運(yùn)動(dòng)均為最低。

表2 凝塊對(duì)于杜洛克公豬精液前向運(yùn)動(dòng)的影響 %

相較于各組采精當(dāng)天的前向運(yùn)動(dòng)值，無(wú)凝塊組的下降變化最為明顯，凝塊過(guò)濾組次之，凝塊組變化最小，7 d 內(nèi)沒(méi)有發(fā)生顯著性下降。

2.4 凝塊對(duì)于杜洛克公豬精液畸形率的影響 由表3可知，無(wú)凝塊組、凝塊組、過(guò)濾組在采精當(dāng)天的畸形率組差異不顯著，但在保存中期（第2～5 天）無(wú)凝塊組低于凝塊組（<0.05）；除第7 天外凝塊組始終保持最高的精液畸形率，所有檢測(cè)數(shù)據(jù)均大幅低于畸形率生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)（<20%）。

表3 凝塊對(duì)于杜洛克公豬精液畸形率的影響 %

3 討論

隨著人工授精在豬生產(chǎn)業(yè)中的普及，精液的體外保存變得尤為重要。體外保存效果決定了優(yōu)秀種公豬基因的傳遞范圍，特別是對(duì)于作為雜交終端父本的杜洛克公豬更是意義重大。在精液保存中容易受到氧化損傷以及細(xì)菌污染的影響，導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)能力下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明存在凝塊的杜洛克公豬精液在長(zhǎng)期保存中更具優(yōu)勢(shì)，能夠很好地維持精液活力和前向運(yùn)動(dòng)能力，這可能是由于凝塊物在抗氧化或是抗菌方面發(fā)揮了一定作用。

精子畸形率是精子形態(tài)參數(shù)，反映其形態(tài)的受損情況?；尉影^部畸形、頸部和中段畸形、主段畸形以及過(guò)多殘留原生質(zhì)，形成畸形精子的原因和機(jī)體感染、精索靜脈曲張、遺傳因素、環(huán)境因素等有關(guān)，畸形精子顯著影響受精率甚至可能導(dǎo)致后代畸形。本實(shí)驗(yàn)中，凝塊組的畸形率在保存中期與其他組存在顯著差異，這可能是由于微凝塊與精子的撞擊在一定程度上加速了精子形態(tài)的損壞，導(dǎo)致畸形率升高這一過(guò)程提前。實(shí)際上在公豬精液生產(chǎn)中通常將20%的畸形率作為生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，本研究中3 組精液樣品的畸形率在保存時(shí)間內(nèi)均低于這一標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明凝塊雖然加速了畸形率的升高但并沒(méi)有對(duì)生產(chǎn)造成較大影響。

凝塊直徑的最大值與精子長(zhǎng)度相近，是源于精漿的不溶物。公豬精漿中包含大量的水、果糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。精漿蛋白種類(lèi)十分豐富，在整個(gè)精卵結(jié)合過(guò)程中起精細(xì)調(diào)控的作用，其中包含參與形成粘蛋白，構(gòu)成射精中凝膠狀不溶物的精膠蛋白。精膠的大量存在會(huì)導(dǎo)致精液凝固，不利于精液體外保存，故采精時(shí)大量精膠蛋白被濾出，可能會(huì)存在直徑小于濾網(wǎng)的蛋白碎片隨精子被保留下來(lái)。精膠蛋白被證明具有抗菌活性，可與精子頂體蛋白形成復(fù)合物以阻止精子提前獲能，使精子存活更久。源于精膠蛋白的多肽也被證明可以激活精子活力?；诖颂岢霾孪耄耗龎K物可能是源于公豬精漿中的精膠碎片，但具體成分為何還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)濾會(huì)造成精液運(yùn)動(dòng)能力的下降，造成這一結(jié)果的原因可能與凝塊的丟失有關(guān)，抑或是過(guò)濾對(duì)于精子造成機(jī)械性損傷。實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)注意避免對(duì)于凝塊的盲目過(guò)濾。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，精液凝塊的存在對(duì)杜洛克公豬精液活力和前向運(yùn)動(dòng)能力無(wú)不利影響，可能來(lái)源于精液有益的精膠蛋白；生產(chǎn)中稀釋后的靜置過(guò)濾操作對(duì)精液活力和前向運(yùn)動(dòng)指標(biāo)有較大的負(fù)面影響，應(yīng)注意避免。