段為鋼，張陸勇

（1.云南中醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.中國藥科大學(xué)新藥篩選中心，江蘇 南京 210009）

中藥注射劑系指藥材經(jīng)提取、純化后制成的供注入體內(nèi)的溶液、乳狀液及供臨用前配制成溶液的粉末或濃溶液的無菌制劑。最早產(chǎn)生在上世紀(jì)四十年代，由錢信忠等前輩開創(chuàng)［1］。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，中藥注射劑已在臨床廣泛應(yīng)用。目前上市使用的中藥注射劑約140個(gè)品種，包括肌注用、穴位注射用、靜脈用注射劑等。中藥注射劑能提升藥效、使某些中藥的療效得到更好地發(fā)揮，但帶來的不良反應(yīng)也時(shí)常發(fā)生，甚至還很嚴(yán)重，使其安全性問題受到了業(yè)界甚至公眾的廣泛關(guān)注，其中以靜脈用注射劑的安全性問題最為突出［2］。目前有很多學(xué)者在提高中藥注射劑安全性方面提出了很多建議［3-4］，但多側(cè)重管理層面的，很少提出具體技術(shù)層面的策略。為此，本研究從較為具體的技術(shù)層面提出相關(guān)策略，以供參考。

1 中藥注射劑的安全性問題主要來自大分子物質(zhì)

中藥注射劑的療效是有物質(zhì)基礎(chǔ)的，同樣，安全性問題必然存在物質(zhì)基礎(chǔ)。由于目前的絕大多數(shù)中藥注射劑由口服制劑上升而來，因此業(yè)界逐漸意識到中藥注射劑的安全性問題主要是大分子物質(zhì)導(dǎo)致的［5-6］。理由是:1)中藥注射劑的安全性問題的臨床表現(xiàn)多與原有藥理作用關(guān)系甚少，多表現(xiàn)為變態(tài) (樣)反應(yīng)，而誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)的直接抗原則屬于大分子物質(zhì)；2)中藥注射劑具有生物提取物的特征，含有微量的大分子物質(zhì)；3)同品種的口服劑安全性很高，但安全性問題幾乎都出現(xiàn)在注射劑，這間接支持中藥注射劑安全性問題的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是大分子物質(zhì)，因?yàn)橄榔琳系拇嬖?，大分子物質(zhì)口服很難直接吸收。比如，小分子物質(zhì)綠原酸曾是中藥注射劑備受爭議的過敏原［7］。但研究證實(shí)不是過敏原［8］，相反，提取物中的大分子物質(zhì)才是引起過敏反應(yīng)的物質(zhì)［8］。

以下將主要從大分子物質(zhì)基礎(chǔ)角度對中藥注射劑相關(guān)物質(zhì)檢查、安全性檢查和大分子物質(zhì)去除提出相應(yīng)的技術(shù)策略。

2 中藥注射劑有關(guān)物質(zhì)檢查法技術(shù)指標(biāo)偏低

根據(jù)以上的簡要分析，作為生物提取物的中藥注射劑可能含有的大分子物質(zhì)有蛋白質(zhì)、核酸、多糖、縮合鞣質(zhì)、樹脂等，也含可能富含草酸 (鹽)、鉀離子等小分子物質(zhì)。除非有特別的研究支持，這些物質(zhì)基本上對中藥注射劑無療效貢獻(xiàn)，或者其貢獻(xiàn)可以忽略。有文獻(xiàn)提出某些植物蛋白質(zhì)具有某些特定生物活性［9-10］，但對于從口服劑上升而來的中藥注射劑而言應(yīng)該不屬于活性成分，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)口服不吸收；另外也有文獻(xiàn)報(bào)道植物多糖具有多種生物活性［11］，但對于從口服劑上升而來的中藥注射劑而言，多糖是不易吸收的，甚至連相對分子質(zhì)量較小的蔗糖 (MW=342)也需水解成單糖才吸收，由此推測也不屬于注射劑預(yù)定的活性成分。因此，提高中藥注射劑大分子物質(zhì)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有利于從物質(zhì)基礎(chǔ)方面提高中藥注射劑的質(zhì)量。

2.1 蛋白質(zhì)檢查 蛋白質(zhì)是強(qiáng)抗原，能誘發(fā)機(jī)體變態(tài)反應(yīng)，且中藥注射中的蛋白多屬于植物蛋白或動物蛋白，與人的種屬差異大，抗原性很強(qiáng)。微量的蛋白質(zhì)能足夠誘發(fā)免疫反應(yīng)，比如成人使用乙肝疫苗一次所需的蛋白量為20 μg［12］。《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)自2000年版以來開始檢查中藥注射劑中的蛋白質(zhì)，采用的方法是磺基水楊酸自然沉淀法?！吨袊幍洹?005年版和2010年版基本上沿用了2000年版，只是在表述上略作修改，無實(shí)質(zhì)性提高。

磺基水楊酸自然沉淀法定量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的下限約為25 μg/mL，在大體積 (10 mL)比濁時(shí)，檢查限可達(dá)12 μg/mL，而在小體積 (2 mL)比濁時(shí)，檢查限約為 37 μg/mL［13］。《中國藥典》采用的小體積比濁 (1 mL注射液和1 mL磺基水楊酸試劑)，因此檢查限不會低于37 μg/mL，中藥注射劑的較深顏色，還會干擾比濁。中藥注射劑的原料多采用醇水法制備，以牛血清白蛋白 (BSA)為例，BSA在70%以上的乙醇中的溶解度可達(dá)20～50 μg/mL，因此乙醇沉淀蛋白質(zhì)是不徹底的，按照磺基水楊酸自然沉淀法檢查，也很難查出陽性結(jié)果。

為此，直接提高中藥注射劑蛋白質(zhì)檢查方法的策略是采用較大反應(yīng)體系進(jìn)行離心沉淀檢查。比如采用5 mL中藥注射劑和5 mL磺基水楊酸試劑混勻后于5000 r/min離心10 min，不得出現(xiàn)沉淀。這樣可以將檢查限下降到1～4 μg/mL，同時(shí)中藥注射劑的顏色也不會干擾。

另外，如果采用富集策略，可以極大地提高檢查靈敏度。比如，將一定體積的中藥注射劑通過PVDF膜小孔，PVDF膜將特異性地吸附溶液中的蛋白質(zhì)，隨后用有機(jī)溶劑洗除中藥注射劑的雜色 (蛋白質(zhì)無色)，此時(shí)再用蛋白質(zhì)特異性染色劑如考馬斯亮藍(lán)顯色來檢查蛋白質(zhì)。本課題的研究表明，根據(jù)此原理建立的方法，其檢查限可達(dá)ng/mL級，同時(shí)具有較強(qiáng)的抗干擾能力，結(jié)果直觀，原始結(jié)果可以長期保存［14-15］。

2.2 縮合鞣質(zhì)檢查 《中國藥典》檢查的是鞣質(zhì)，包括鞣質(zhì)單體和縮合鞣質(zhì)，因?yàn)閱误w鞣質(zhì)和縮合鞣質(zhì)均能被蛋白質(zhì) (1%雞蛋清生理鹽水溶液和明膠溶液)沉淀。自2000年版以來，《中國藥典》對鞣質(zhì)的檢查僅有表述調(diào)整，也無實(shí)質(zhì)性提高。令人遺憾的是，《中國藥典》方法對加入附加劑聚乙二醇和聚山梨酯的中藥注射劑成品無法檢查［16］，使得某些成品中藥注射劑超標(biāo)的縮合鞣質(zhì)無法受到監(jiān)控。從原理上看，該方法也不太適合中藥注射劑，因?yàn)樵絹碓蕉嗟难芯勘砻鲉误w鞣質(zhì)屬于活性物質(zhì)，如柯里拉京［17］、兒茶素［18］等就具有較好的生物活性，也能被口服吸收。實(shí)際上只有縮合鞣質(zhì)口服不吸收，對中藥注射劑無活性貢獻(xiàn)，相反還會帶來安全性問題?？s合鞣質(zhì)顏色深水溶性差，容易產(chǎn)生不溶微粒，也能與蛋白質(zhì)形成復(fù)合沉淀，起到增強(qiáng)抗原的作用。因此，中藥注射劑應(yīng)檢查縮合鞣質(zhì)而非單體鞣質(zhì)。

其次，在鞣質(zhì)的檢查方面，由于《中國藥典》采用蛋白質(zhì)自然沉淀法，檢查限量偏高，盡管文獻(xiàn)聲稱此法對標(biāo)準(zhǔn)鞣質(zhì) (鞣酸)的檢查限可達(dá)50～100 μg/mL［19］。但本課題以氧化縮合的沒食子酸溶液 (20 mg/mL沒食子酸溶液，放置后A410＞3)為例，藥典方法的檢出限＞6 mg/mL(見表1)。

表1 不同檢查方式的鞣質(zhì)檢查結(jié)果*

在提高檢測靈敏度方面，如果采用離心沉淀法，檢查限將會降低到6 mg/mL左右 (以上述沒食子酸溶液計(jì))。

如果進(jìn)一步改進(jìn)方法，采用蛋白質(zhì)包被的PVDF膜來檢測，對注射劑中的縮合鞣質(zhì)檢查限可達(dá)70 μg/mL(見表1)［20］。該法仍是利用蛋白質(zhì)與鞣質(zhì)形成復(fù)合物的原理。由于縮合鞣質(zhì)與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物仍具有顏色，而且?guī)缀醪蝗苡诔Ｒ姷挠袡C(jī)溶劑 (包括DMSO)，因此也會排除單體鞣質(zhì)的干擾，檢查的針對性增強(qiáng)。

2.3 樹脂檢查 中藥注射劑中的樹脂也屬于大分子物質(zhì)，容易轉(zhuǎn)化成不溶性顆粒，影響注射劑質(zhì)量。天然樹脂具有較高的脂溶性，《中國藥典》采用鹽酸自然沉淀法檢查［16］。自2000年版以來，《中國藥典》對樹脂的檢查僅有表述調(diào)整，仍未見實(shí)質(zhì)性提高。同樣，由于中藥注射劑的顏色較深，對自然沉淀的觀察有較大干擾，如果采用離心沉淀法觀察，檢查靈敏度將會增加2～3倍。

2.4 核酸、多糖檢查 由于中藥注射劑屬于生物提取物，大分子物質(zhì)核酸和多糖也可能帶入到中藥注射劑中。核酸在無水乙醇中的溶解度約為15 μg/mL，在70%乙醇中的溶解度約為90 μg/mL。盡管一般資料都聲稱多糖不溶于乙醇，但中藥注射劑還是可能會帶入多糖類成分。然而，歷版《中國藥典》對這兩類大分子未納入檢查。

植物核酸屬于異源性核酸，目前尚未見藥用活性報(bào)道，也不能直接吸收。因此對于從口服劑上升而來的中藥注射劑而言，應(yīng)不屬于活性成分，相反，核酸也具有一定的抗原性 (如臨床上某些疾病能檢測到抗DNA抗體［21］)，也能增強(qiáng)其他抗原 (如蛋白質(zhì))的抗原性。

多糖物質(zhì)的活性報(bào)道較多，多集中在增強(qiáng)機(jī)體免疫方面［11］，如靈芝多糖［22］。但機(jī)體對多糖很難直接吸收，目前也很難找到植物多糖直接吸收的證據(jù) (也許多糖口服起作用不依賴吸收，或通過刺激消化道起作用)，因此推測不屬于中藥注射劑的有效物質(zhì)。如果將植物多糖注入體內(nèi)，其增強(qiáng)免疫作用很可能就成為促進(jìn)變態(tài)反應(yīng)的作用，誘發(fā)機(jī)體變態(tài)反應(yīng)。

因此，核酸和多糖大分子物質(zhì)也應(yīng)該納入中藥注射劑中的檢查范圍。

2.5 關(guān)于大分子物質(zhì)的儀器檢查 采用高靈敏度的儀器檢查某些具體物質(zhì)，具有很多優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在檢測靈敏度方面。比如SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢查某種蛋白質(zhì)的靈敏度也可達(dá)ng級，質(zhì)譜檢測也常能達(dá)到ng級，ELISA(酶聯(lián)吸附免疫)檢測可達(dá)pg級［23］。然而，中藥注射劑中大分子物質(zhì)是由很多分子量不均一、理化性質(zhì)也不均一的分子組成的，經(jīng)SDS-PAGE分離后，每個(gè)蛋白質(zhì)的含量可能都低于檢測限，導(dǎo)致信號被噪音淹沒；質(zhì)譜檢測也存在類似的問題，某一具體大分子物質(zhì)因豐度不夠仍可能被檢測噪音淹沒；普通HPLC由于采用分離檢測原理，檢測器多為UV檢測器，大分子物質(zhì)峰并不存在特異性，即使含量很高也會受其他指紋峰干擾而無法指認(rèn)；ELISA檢測的信號放大率很高，但只針對某個(gè)特異性分子。因此儀器檢查對具體大分子物質(zhì)檢測具有多種優(yōu)勢，但對中藥注射劑的大分子物質(zhì)檢查優(yōu)勢不明顯。

2.6 草酸鹽和鉀離子檢查 《中國藥典》對中藥注射劑中的草酸鹽和鉀離子也進(jìn)行了檢查。根據(jù)本課題的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)推算，《中國藥典》對中藥注射劑草酸鹽的最高容忍度約為2.47 mmol/L(人體血總鈣參考值為2.1～2.6 mmol/L)。而對鉀離子的最高容忍度為1 mg/mL，相當(dāng)于25 mmol/L(人體血鉀參考值為3.5～5.5 mmol/L)。

表2 草酸鹽氯化鈣沉淀檢查結(jié)果

草酸鹽的主要毒性是絡(luò)合鈣離子，心血管毒性明顯，鉀離子的毒性也主要表現(xiàn)在心血管系統(tǒng)。按照目前中藥注射劑的草酸鹽和鉀離子的最高容忍度，如果采用靜脈推注，可能會引發(fā)一過性低血壓甚至低血壓休克；而靜脈滴注的速度較慢，對機(jī)體的不良反應(yīng)相對較小［24］。如要提高標(biāo)準(zhǔn)，可以采用離心沉淀法 (見表2)或加大取樣體積等進(jìn)行檢查，但是考慮到生產(chǎn)的難度 (草酸鹽和鉀離子在生產(chǎn)中很難進(jìn)行選擇性去除)，暫不建議提高標(biāo)準(zhǔn) (見后述)。

3 關(guān)于安全性檢查

3.1 目前中藥注射劑安全性檢查存在的主要缺陷 自2005年版，《中國藥典》增加了《中藥注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則》內(nèi)容，涉及到異常毒性檢查、降壓物質(zhì)檢查、過敏反應(yīng)檢查、溶血與凝集檢查以及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，也保留著中藥注射劑的熱原檢查 (表3)。對比2005年版，2010年版《中國藥典》對安全性檢查也無實(shí)質(zhì)性提高。提高安全性檢查的陽性率有利于發(fā)現(xiàn)并評估中藥注射劑的安全性，為臨床用藥提供參考；而有效提高安全性檢查的標(biāo)準(zhǔn)，有利于從生物學(xué)角度提高中藥注射劑的質(zhì)量。

從原理上講，安全性檢查屬于小概率檢查，而藥理作用研究屬于大概率研究。小概率檢查和大概率研究應(yīng)該在方法學(xué)上有所區(qū)別。根據(jù)報(bào)道，目前臨床上出現(xiàn)的中藥注射劑不良反應(yīng)的總體發(fā)生率為2% (盡管某些反應(yīng)很嚴(yán)重)，大多品種的不良反應(yīng)發(fā)生率在5%以下，少數(shù)超過10%，個(gè)別可達(dá)40%(華蟾素注射液)［25］。

在檢查樣本量上，目前《中國藥典》方法進(jìn)行安全性檢查的思路仍沿用藥理方法的思路，比如異常毒性只用5只小鼠，過敏反應(yīng)檢查只用6只豚鼠，降壓物檢質(zhì)查只用1只貓(《中國藥典》未明確規(guī)定是幾只，但從表述上看應(yīng)該是 1 只)［16］。

表3 《中國藥典》的中藥注射劑安全性檢查項(xiàng)目

動物實(shí)驗(yàn)和化學(xué)實(shí)驗(yàn)的最大差別在于前者的個(gè)體差異較大，要想獲得陽性結(jié)果，就必須有一定的樣本量。由于藥理作用一般屬于大概率研究，小動物10只，大動物3～6只就能反映出其藥理作用。相反，安全性檢查屬于小概率研究，小量動物很難排除某些不良反應(yīng)不會發(fā)生，除非不良反應(yīng)的發(fā)生率也成為大概率事件。在當(dāng)前《中國藥典》推薦的動物數(shù)下，對反應(yīng)率為5%以下不良反應(yīng)檢出率很低(＜30%)，如果檢出率要達(dá)到80%，動物不良反應(yīng)的理論出現(xiàn)率將成為非小概率事件了 (表4)。

表4 不良反應(yīng)發(fā)生率和檢出率的推算

3.2 解決策略 要提高安全性檢查的陽性率可以從三方面解決:1)選用敏感動物模型；2)增加檢查動物數(shù)；3)根據(jù)目前認(rèn)識有針對性地富集中藥注射劑某些成分。

目前《中國藥典》方法已經(jīng)是采用公認(rèn)的敏感動物或較理想動物。要想獲得更敏感的模型動物，牽涉到動物品種改造，短期內(nèi)不大可行。

增加安全性檢查陽性率的直接方法就是增加檢查樣本量，假定動物的不良反應(yīng)率為1%、5%、10%時(shí)，不同動物數(shù)的檢出率存在較大差別，但動物數(shù)的增加能夠增加檢出率，增加到多少，可以由相關(guān)專家確定。但必須清醒的是，增加動物數(shù)并不能無限增加小概率不良反應(yīng)的檢出率。即使在最佳的飼養(yǎng)環(huán)境中，動物仍存在一定的發(fā)病率或死亡率 (盡管概率發(fā)生率很小)，動物自發(fā)的異常會干擾結(jié)果判斷。

表5 不同動物數(shù)對不同發(fā)生率不良反應(yīng)的檢出率/%

但增加檢查樣本量還將增加檢查成本，特別是人力成本。為此，有必要提出新的檢查策略。如果根據(jù)中藥注射劑不良反應(yīng)的特點(diǎn)，對中藥注射劑中的某些物質(zhì)富集，采用現(xiàn)有模型 (不增加樣本量或稍微增加樣本量)，也會顯著提高安全性檢查的陽性率。將微量大分子物質(zhì)注射到體內(nèi)是中藥注射劑的顯著特點(diǎn)，富集大分子有望增加安全性檢查的陽性率。

對此，可以將納濾技術(shù)結(jié)合起來，用納濾膜將相對分子質(zhì)量＞3000或5000的大分子物質(zhì)富集，獲得富含大分子注射劑，這種注射劑樣品能大幅度增加檢測的靈敏度。比如，本課題組將上市的清開靈注射液100 mL，用10000納濾膜富集得到25 mL富含大分子注射液 (固體物總含量與原注射液一致)，富含大分子注射液給小鼠腹腔注射則發(fā)生明顯的扭體反應(yīng)。相似地，雙黃連注射液富含大分子注射液能誘發(fā)豚鼠過敏反應(yīng)。但用清開靈注射液和雙黃連注射液原液和去大分子注射劑則未見異常發(fā)現(xiàn) (數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。

4 中藥注射劑安全性提高的方法

4.1 去除大分子物質(zhì) 根據(jù)以上分析，要提高中藥注射劑的安全性，去除中藥注射劑中的大分子物質(zhì)是一個(gè)有效的策略。除非有特別的研究支持，對于從口服劑上升而來的中藥注射劑而言，大分子物質(zhì)無療效貢獻(xiàn)，相反還可能帶來了安全性問題。以2010年版《中國藥典》二部收載的2271個(gè)藥物 (品種)為例，在口服治療全身疾病的藥物中，相對分子質(zhì)量大于500的較少，大于1000的只有少數(shù)幾個(gè)，大于3000的則沒有。因此中藥注射劑中相對分子質(zhì)量大于3000的物質(zhì)就不大可能是有效成分了。理論上講，相對分子質(zhì)量大于3000的分子都必須去除，由于相對分子質(zhì)量越小，去除難度越大，因此廠家可以結(jié)合實(shí)際情況，選擇分子量去除范圍，或逐步實(shí)現(xiàn)去除3000以上分子量物質(zhì)。本課題組初步的實(shí)驗(yàn)表明，去除大分子物質(zhì)后對中藥注射劑指紋圖譜的影響很小 (＜5%)，提示去除大分子物質(zhì)后的中藥注射劑無明顯療效改變 (數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。

在生產(chǎn)方面，只要在目前工藝基礎(chǔ)上增加一道分子篩工藝就可以實(shí)現(xiàn)大分子去除，去除的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、縮合鞣質(zhì)、樹脂、核酸、多糖、熱原以及微生物等。盡管增加工藝會增加一定的生產(chǎn)成本，但從提高中藥注射劑安全性角度考慮，適度增加成本是值得的。

4.2 去除某些小分子物質(zhì) 小分子物質(zhì)是中藥注射劑療效的貢獻(xiàn)者，但共性小分子草酸鹽和鉀離子對機(jī)體的療效貢獻(xiàn)小，且會帶來心血管毒性。盡管草酸鹽可以通過鈣劑沉淀去除，但鈣劑也可能沉淀其他活性分子如黃酮類成分，從而導(dǎo)致活性成分丟失，影響注射劑的有效性。而鉀離子可以通過陽離子交換樹脂進(jìn)行去除，但此去除方式可能會影響到其他陽離子活性成分，比如生物堿。目前也未見中藥注射劑選擇性去除草酸鹽和鉀離子的方法報(bào)道，且分子篩對這些小分子也無法選擇性去除。因此，從生產(chǎn)環(huán)節(jié)進(jìn)一步去除草酸鹽和鉀離子尚存難度。所以，單純提高草酸鹽和鉀離子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)實(shí)意義不大，但是為了減少草酸鹽和鉀離子的毒性，應(yīng)該禁止中藥注射劑靜脈推注。

另在2012年6月9日召開的“2012年全國中藥注射劑安全性評價(jià)及質(zhì)量控制學(xué)術(shù)研討會”上獲悉，適度采用離子交換或電滲析技術(shù)可以在不明顯改變活性成分的基礎(chǔ)上進(jìn)一步控制鉀離子。

必須指出的是，本研究不否認(rèn)不同中藥注射劑中某些特別的小分子物質(zhì)也參與了安全性問題。由于這屬于中藥注射劑品種的個(gè)性問題，本研究不予討論。

5 結(jié)語

中藥注射劑從誕生到現(xiàn)在，經(jīng)歷了六七十個(gè)年頭，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，生產(chǎn)技術(shù)也在不斷改進(jìn)。中藥注射劑的安全性存在共性問題和個(gè)性問題，其問題不可能通過某一個(gè)技術(shù)全部解決。但從監(jiān)控大分子物質(zhì)為切入點(diǎn)，有利于解決中藥注射劑的共性安全問題，將產(chǎn)品質(zhì)量上升到一個(gè)更高的水平。

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