黃幀檜， 崔衛(wèi)東， 張年寶， 丁伯平

（皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室及中藥藥理國家三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241002）

杜鵑花科植物羊躑躅廣泛分布于長江流域，其花、葉、根均可入藥，有鎮(zhèn)痛、免疫、解熱和降壓的功效［1-2］，在發(fā)揮以上積極治療作用的同時(shí)也具有一定的毒性，可出現(xiàn)行走困難、下肢癱瘓、呼吸急促甚至死亡［3］。β受體阻斷劑是抗高血壓常用藥，美托洛爾由于缺乏內(nèi)在擬交感活性，長期應(yīng)用會(huì)引起血脂升高。但羊躑躅果實(shí)水煎液與美托洛爾聯(lián)合應(yīng)用的效果未見報(bào)道，本研究旨在探討羊躑躅果實(shí)水煎液聯(lián)用美托洛爾是否可以在減少各用藥劑量、減輕不良反應(yīng)的同時(shí)，能夠達(dá)到與單用各藥相似的降壓作用，并且有效地調(diào)節(jié)血脂，并分析其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SHR大鼠32只(12周，體質(zhì)量230～250 g)，飼養(yǎng)條件:溫度(23±2)℃，相對濕度60% ～65%，自然光照，自由飲食進(jìn)水。動(dòng)物購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào):SCXK(京)2006-0009。飼料購于南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物與試劑 羊躑躅果實(shí)1 kg購自亳州華申藥業(yè)有限公司(中藥材經(jīng)營資格證號(hào):Z34200300258)，為道地藥材，經(jīng)水熬煮濃縮［4］(含生藥1 g/1 mL)，制成羊躑躅果實(shí)水煎液；美托洛爾(批號(hào)H32025391)由阿斯得康制藥有限公司生產(chǎn)；考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒、NO、MDA、ET-1、ANGⅡ試劑盒均購自南京建成生物有限公司。

1.3 儀器 日立7600型全自動(dòng)生化分析儀；TGL-16G-A冷凍離心機(jī)；UV-9100分光光度計(jì)；ALC-NIBP無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測定分析系統(tǒng)等。

1.4 方法 32只SHR大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為4組:美托洛爾組(給藥劑量為5.8 mg/kg)、羊躑躅果實(shí)水煎液組(水煎液組，給藥劑量為1.5 g/kg)［5］、羊躑躅果實(shí)水煎液聯(lián)合美托洛爾組(聯(lián)用組，給藥劑量為羊躑躅果實(shí)水煎液0.75 g/kg、美托洛爾2.9 mg/kg)、模型組和 Wistar-kyoto大鼠空白組(模型組和空白組給予同容積生理鹽水)，每組8只。每天上午10點(diǎn)灌胃給藥(1.0 mL/100 g)，每天一次，連續(xù)4周。尾袖法測大鼠尾動(dòng)脈血壓，給藥前測一次，以后每周測一次(每次測量3次，取平均動(dòng)脈壓)。給藥4周后，用25%烏拉坦(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血后，迅速取出腎臟。血液注入含10%EDTA-Na230 μL和抑肽酶40 μL的試管中，4℃，3000 r/min離心 10 min，分離血漿，－20℃保存，待測血脂、MDA、ET-1及NO。取出一側(cè)腎臟留作HE及Masson染色，觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)變化及半定量評分。評分方法為:光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)一放大10×20倍，觀察腎臟組織形態(tài)。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，觀察腎臟纖維化程度，將其分成0～3級(jí)并予評分:0為正常腎臟組織，膠原占視野面積小于5%，評為0分；1為輕度纖維化，膠原蛋白占視野面積小于10%，評為1分；2為中度纖維化，膠原蛋白占視野面積11% ～20%，有少量炎性細(xì)胞浸潤，評為2分；3為重度纖維化，膠原蛋白占視野面積大于20%，且有明顯炎性細(xì)胞浸潤，評為3分。將10個(gè)視野評分疊加求算總分。取另外一側(cè)腎臟，留測腎臟局部AngⅡ水平。

1.5 數(shù)據(jù)處理 采用spss16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)值以表示，組間比較采用方差分析，顯著性水平P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同用藥組對SHR大鼠的降壓作用 用藥前，各組SHR大鼠血壓無差別(P＞0.05)。用藥后，各給藥組與模型組比較均有不同程度的降壓作用，隨著給藥時(shí)間的延長，降壓作用越明顯(P＜0.05或P＜0.01)。各給藥組間在1～4周內(nèi)降壓作用無明顯差別(P＞0.05)。見表1。

表1 不同用藥組對SHR的降壓作用 (1 mmHg=0.133322 kPa)(，n=8)

表1 不同用藥組對SHR的降壓作用 (1 mmHg=0.133322 kPa)(，n=8)

注:與空白組相比，▼ P＜0.05，▼▼P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01；與美托洛爾組相比△P＜0.05，△△P＜0.01，下同。

組別 用藥前 劑量/(mg·kg －1)用藥后1周后 2周后 3周后 4周后空白組 130.18±11.67 － 132.78±15.43 128.96±9.89 140.87±12.22 133.77±18.88模型組 163.56±8.79▼▼ － 179.00±7.88 182.48±6.91 185.18±4.56 193.77±10.79美托洛爾組 168.96±9.14▼▼ 5.8 167.76±7.17* 157.22±13.12＊＊ 148.50±8.36＊＊ 136.14±8.76＊＊水煎液組 171.63±7.83▼▼ 1500 164.84±9.56＊＊ 160.12±9.09＊＊ 150.23±9.91＊＊ 134.13±9.89＊＊聯(lián)用組 170.67±8.44▼▼ 2.9+750 161.18±7.03＊＊ 154.64±14.11＊＊ 146.91±7.39＊＊ 139.88±10.00＊＊

2.2 不同用藥組對腎臟局部AngⅡ水平的影響 SHR組與空白組比較，腎臟局部AngⅡ水平顯著升高(P＜0.01)。各用藥組同模型組相比，AngⅡ水平表現(xiàn)為不同程度的下降(P＜0.01)。聯(lián)合用藥組與各單用組相比，AngⅡ水平下降更為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。見表2。

表2 不同用藥組對腎臟局部AngⅡ水平的影響

2.3 不同用藥組對血漿MDA、ET-1和NO水平的影響 各給藥組與模型組比較，均表現(xiàn)為MDA下降(P＜0.05或P＜0.01)，聯(lián)用組與美托洛爾、水煎液兩組比較，差異具有顯著性(P＜0.05)。同模型組相比，各用藥組均使ET-1明顯降低(P＜0.01)；而聯(lián)用組較單用美托洛爾組與水煎液組對ET-1的生成抑制作用更顯著(P＜0.01)。而NO的結(jié)果與前兩個(gè)指標(biāo)的情況恰好相反，即各用藥組NO水平與模型組相比均表現(xiàn)為程度不同的升高(P＜0.05或P＜0.01)，聯(lián)合用藥組與單用各藥組比較，NO的升高更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

2.4 各用藥組對血漿TC、TG、LDL-C及HDL-C水平的影響美托洛爾組同模型組比較，TC、TG、LDL-C升高(P＜0.01)，HDL-C降低(P＜0.01)；水煎液組同模型組相比，血脂變化無差異(P＞0.05)。聯(lián)合用藥組與模型組比較TC、TG、LDL-C水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但HDL-C同模型組相比卻表現(xiàn)為明顯升高(P＜0.01)。見表4。

表3 各用藥組對血漿MDA、ET和NO水平的影響 (，n=8)

表3 各用藥組對血漿MDA、ET和NO水平的影響 (，n=8)

組別 劑量/(mg·kg－1) MDA/(μmol·L －1) ET-1/(ng·L－1) NO/(μmol·L－1)

表4 各用藥組對血漿TC、TG、LDL-C及HDL-C水平的影響(，n=8)

表4 各用藥組對血漿TC、TG、LDL-C及HDL-C水平的影響(，n=8)

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2.5 不同用藥組腎臟切片HE及Masson染色纖維化程度半定量分析 水煎液組與模型組相比，腎小球體積增大，細(xì)胞數(shù)量增多，腎小球內(nèi)有纖維素滲出。腎小球、腎間質(zhì)大片紅染，細(xì)胞核減少、溶解，有中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤。美托洛爾組、聯(lián)合用藥組同水煎液組相比，腎小球體積明顯減小，纖維化不明顯。腎小管并未發(fā)生萎縮，腎間質(zhì)也無充血消腫，炎性細(xì)胞很少。見圖1～2。

圖1 不同用藥組腎臟組織HE染色光鏡下表現(xiàn)(×200)

圖2 各組大鼠典型腎臟纖維化Masson染色切片(×200)

Masson染色結(jié)果及半定量分析結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組和美托洛爾組與模型組比較纖維化程度明顯減輕(P＜0.01)，而水煎液組與模型組相比腎臟出現(xiàn)了纖維化(P＜0.01)。聯(lián)合用藥組與美托洛爾組相比表現(xiàn)出了更好的降低腎臟纖維化作用，差異有顯著性(P＜0.05)。見表5。

表5 不同用藥組腎臟纖維化評分

3 討論

高血壓影響重要臟器如心、腎的結(jié)構(gòu)和功能，最終可導(dǎo)致這些靶器官的衰竭。常用抗高血壓藥物可使患者產(chǎn)生頭痛、下肢浮腫、血管性水腫、干咳等一系列不良反應(yīng)。β受體阻斷劑美托洛爾雖然降壓顯著，但長期使用可引起血脂升高。中藥在治療高血壓時(shí)由于其作用溫和，毒副作用較小，在高血壓的治療中起著舉足輕重的作用。羊躑躅的果實(shí)又稱八厘麻或六軸子，民間常用其驅(qū)風(fēng)除濕、消腫止痛。羊躑躅果實(shí)的水煎液在發(fā)揮快速降壓作用的同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)不良反應(yīng)，表現(xiàn)為呼吸抑制、驚厥等［6］。本實(shí)驗(yàn)采用羊躑躅果實(shí)的水煎液聯(lián)合美托洛爾，探討此聯(lián)用組與單用各藥組相比，是否可以在保持良好降壓作用的同時(shí)，能減輕對血脂的不良影響。

各用藥組與模型組相比均表現(xiàn)出了良好的降壓作用，聯(lián)合用藥組與單用各藥組降壓作用相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SHR模型組血壓由給藥前的163.56 mmHg升高到193.77 mmHg，這一現(xiàn)象符合SHR生長期血壓變化，同時(shí)也說明了單用美托洛爾或羊躑躅果實(shí)水煎液及兩者聯(lián)合應(yīng)用對處于血壓上升期的SHR血壓都有良好的降壓作用。

MDA是生物膜中多價(jià)不飽和脂肪酸受自由基作用生成的脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物，主要存在于低密度脂蛋白膽固醇中，檢測MDA可以間接反映抗脂質(zhì)過氧化作用的程度。本研究發(fā)現(xiàn)各給藥組血漿中MDA明顯低于模型組，說明無論是美托洛爾還是羊躑躅果實(shí)水煎液都可以通過減少脂質(zhì)過氧化的程度而發(fā)揮抗高血壓作用。同時(shí)也看到聯(lián)用組與單用各藥組比較可以更好地抵抗脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，說明聯(lián)合用藥效果要比單用其中某一藥物效果好。

血管內(nèi)皮功能失調(diào)導(dǎo)致舒張因子與收縮因子分泌失衡，是影響高血壓心血管重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)［7］。車在前等［8］認(rèn)為NO可能通過抑制成纖維細(xì)胞增殖及膠原的合成，影響高血壓病的發(fā)生和發(fā)展。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各用藥組NO與模型組相比有不同程度的升高，而聯(lián)用組與單用各藥組比較，其升高的程度更為明顯，提示聯(lián)合用藥可以使NO生成增多，其機(jī)制可能是與鳥苷酸環(huán)化酶的活性升高有關(guān)。

目前認(rèn)為ET收縮血管活性最強(qiáng)，作用比血管緊張素強(qiáng)10倍，它由多種組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌后，通過自分泌或者旁分泌的形式和ET受體結(jié)合，引起細(xì)胞外鈣內(nèi)流，起到收縮血管的作用。實(shí)驗(yàn)中觀察到，聯(lián)合用藥組與單用各藥組相比差別有顯著性，提示聯(lián)合用藥后抑制內(nèi)皮細(xì)胞分泌ET更為明顯。

在腎臟局部，活性增高的AngⅡ直接或間接誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子-β表達(dá)，刺激腎臟局部纖溶酶原激活物抑制劑-I等的表達(dá)，促進(jìn)腎小管間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖、分化，導(dǎo)致大量單核巨噬細(xì)胞浸潤腎小球，細(xì)胞外基質(zhì)成分合成增多、降解減少，這一局部作用日益引起人們的關(guān)注［9］。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出SHR腎臟局部AngⅡ水平較空白組相比明顯升高，單用各藥和聯(lián)合用藥均可以收到明顯的降低AngⅡ水平的效果。結(jié)果也顯示，聯(lián)合用藥較單用各藥在減少各用藥劑量的同時(shí)，可以起到更好的降低腎臟局部AngⅡ的作用。

Xie F等［10］研究表明，高血脂這一危險(xiǎn)因素可以協(xié)同高血壓對心臟造成更嚴(yán)重的損害。本次結(jié)果顯示，美托洛爾組與模型組相比，LDL-C、TG、TC物質(zhì)的量濃度升高，HDL-C降低，這一點(diǎn)與趙憲平等［11］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。水煎液組與模型組比較血脂變化無明顯差別；聯(lián)用組LDL-C、TG、TC與模型相比無明顯差異，而HDL-C卻升高。說明聯(lián)合用藥可以使HDL-C升高，對機(jī)體具有保護(hù)作用。

腎臟損害表現(xiàn)為小管間質(zhì)纖維化、腎實(shí)質(zhì)丟失、腎小球硬化，有炎癥細(xì)胞浸潤，腎內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)異常增多和過度沉積，最后導(dǎo)致固縮腎［12-13］。從腎臟的HE組織切片可以看到，水煎液組可引起腎臟纖維化，美托洛爾組和聯(lián)用組纖維化不明顯。聯(lián)合用藥組與美托洛爾組相比具有更加明顯的降低腎臟纖維化作用。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示聯(lián)合用藥不但可以通過減輕脂質(zhì)過氧化的程度，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能，使它合成的ET-1減少，同時(shí)又增加NO的釋放，內(nèi)皮細(xì)胞重新處于對機(jī)體有利的最佳狀態(tài)，發(fā)揮更好的降壓效果，同時(shí)還有阻止高血壓的易損靶器官腎臟的纖維化的可能。對腎臟的這一保護(hù)作用尚需增加樣本例數(shù)和延長觀察時(shí)間加以證實(shí)。本研究還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥對血脂的影響，在不影響LDL-C、TG、TC的情況下卻可以使HDL-C升高。但其對血脂影響的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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