姜麗珍， 胡端龍， 奚靜芳， 沈 瑩， 張國明

（上海市中藥研究所，上海 201401）

靈芝膠囊是由靈芝藥材提取的單味制劑，具有寧心安神、健脾和胃的功效。用于失眠健忘、身體虛弱、神經(jīng)衰弱等癥［1］。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)“中藥成方制劑”第四冊，但無定量測定項(xiàng)。2010年版中國藥典中，靈芝藥材有定量測定項(xiàng)，但其測定對象是以葡萄糖為對照品的紫外-可見分光光度法測定靈芝多糖［2］。顯然該方法缺乏專一性，特別是在含有淀粉類輔料的制劑中會引起干擾，且意義不大。為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，有必要建立特異性更高的定量測定方法。

靈芝中的腺苷是一種活性很強(qiáng)的物質(zhì)，是近年所發(fā)現(xiàn)的有效成分之一，它能提高血液供氧能力和加速血液微循環(huán)，提高血液對心腦的供氧能力［3］。靈芝膠囊中腺苷檢測近年較多采用高效液相色譜法［4-8］，本實(shí)驗(yàn)針對靈芝膠囊品種特點(diǎn)，對流動(dòng)相選擇以及樣品前處理等方面作了部分改進(jìn)，建立了靈芝膠囊高效液相色譜法測定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀，G1365B MWD檢測器。

1.2 藥品和試劑 腺苷(中國藥品生物制品檢定所提供，批號879-200202)；樣品:靈芝膠囊(上海雷允上藥業(yè)有限公司提供，批號 100301，100315，100327)；乙腈、甲醇為色譜純，試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫30℃；流動(dòng)相乙腈-水(7 ∶93)，檢測波長260 nm，體積流量1.0 mL/min，理論塔板數(shù)不低于5000。

2.2 對照品溶液的制備 取腺苷對照品適量，精密稱定，加15%甲醇制成每1 mL含2 μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱定約1.5 g，置25 mL量瓶中，加15%甲醇約20 mL，超聲15 min，取出，放冷，加15%甲醇至刻度，搖勻，過0.45 m濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備 按工藝處方，制備不含靈芝的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn) 照上述色譜條件，精密量取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀。在腺苷對照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰，且與其它成分的色譜峰分離良好。而陰性液在腺苷保留時(shí)間處無色譜峰，不存在干擾(見圖1)。

圖1 靈芝膠囊中腺苷測定高效液相色譜圖

2.6 線性關(guān)系的考察 稱取腺苷對照品適量，精密稱定，加15%的甲醇制成質(zhì)量濃度為1.9050 μg/mL的對照品溶液，分別精密吸取5、10、20 μL；另15%的甲醇制成質(zhì)量濃度為16.0000 μg/mL 的對照品溶液，分別精密吸取 5、10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測定，測得峰面積值。

以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=3099.1X－7.2753，r=0.9995。結(jié)果表明腺苷進(jìn)樣量在0.0095～0.1600 μg范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取質(zhì)量濃度為1.91 μg/mL的腺苷對照品溶液20 μL，按上述色譜條件，重復(fù)測定6次，記錄峰面積，結(jié)果分別為:101.0、102.0、99.44、103.5、100.5、103.1，RSD為1.70%(n=6)，結(jié)果表明本試驗(yàn)精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號為100301的樣品，按供試品方法制備，按上述色譜條件，于 0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果RSD為1.94%(n=7)，結(jié)果表明供試品溶液中含有的腺苷在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號為100301的樣品，一式6份，按供試品方法制備，按上述色譜條件測定。測定的平均含有量為10.30 μg/粒，RSD 為1.89%(n=6)，結(jié)果表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.10 回收率試驗(yàn) 取批號為100301的樣品適量，一式9份，取0.75 g，精密稱定，加入一定量的對照品，按供試品制備方法制備，按上述色譜條件注入液相色譜儀測定，見表1。結(jié)果平均回收率為99.60%，RSD為1.28%(n=9)，結(jié)果表明該方法穩(wěn)定可靠。

表1 回收率試驗(yàn)(n=9)

2.11 樣品測定 取樣品(1) 100301；樣品(2) 100315；樣品(3)100327，按供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件，精密吸取對照品溶液、供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，見表2。

表2 樣品測定結(jié)果(n=3)

3 討論

報(bào)道的高效液相色譜法測定靈芝膠囊中腺苷的流動(dòng)相，主要采用甲醇或乙腈與磷酸溶液［6］或磷酸二氫鉀溶液［5，7］或磷酸緩沖溶液［4，8］組合而成，而本實(shí)驗(yàn)采用簡單的乙腈-水(7∶93)系統(tǒng)，腺苷分離狀況良好，保留時(shí)間也適中，更為關(guān)鍵的是它避免了鹽類或酸類成分的使用，這對延長分析色譜柱使用壽命有著非常實(shí)在的意義。

靈芝膠囊中腺苷含有量較低，每粒在微克量級水平，故在樣品前處理方法確定方面，尤其需要重視實(shí)驗(yàn)篩選優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)比較了樣品回流提取與超聲提取效果，發(fā)現(xiàn)超聲的明顯優(yōu)于回流方法；在提取溶媒選擇上，平行比較了15%、50%和90%甲醇的實(shí)際提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15%甲醇提取者含有量高、雜質(zhì)少、峰形好。

對比現(xiàn)有的靈芝膠囊腺苷測定報(bào)道，發(fā)現(xiàn)提取溶媒出現(xiàn)多種選擇，既有使用 90%甲醇［6，8］的，也有采用水［4］的，甚至還有用流動(dòng)相［5，7］(甲醇-磷酸二氫鉀，10 ∶90)來提取的，對于這種狀況，這可能是報(bào)道者僅對自己被測的某個(gè)具體產(chǎn)品選定溶媒，而實(shí)際情況是，不同生產(chǎn)廠家的靈芝膠囊，其所含輔料種類肯定有所不同(部頒標(biāo)準(zhǔn)未對輔料種類作出明確規(guī)定)，這就有可能產(chǎn)生上述采用不同溶媒的情況。

靈芝藥材的水提取得率不高，必然造成膠囊中含較多量的輔料，這些輔料對微量腺苷測定究竟會產(chǎn)生怎樣的影響目前尚不清楚，盡管報(bào)道者均作過回收率測定，但根據(jù)中藥制備過程實(shí)際情況，這種回收率并不能完全反映出膠囊制備后大量不同類輔料對微量腺苷所產(chǎn)生的吸附。報(bào)道［4］稱9家膠囊產(chǎn)品的腺苷量差異很大(每粒12～137 μg)，顯然這主要是產(chǎn)品質(zhì)量高低問題，但也不能排除不同廠家使用不同輔料所產(chǎn)生的測定偏差。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)［S］，WS3-B-0753-91.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:174.

［3］陳國良，陳曉清.靈芝有效成分研究綜述［J］.中國食用菌，1995，14(4):7-9.

［4］邱文煒，翁雪萍.靈芝膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及質(zhì)量評價(jià)［J］.中藥材，2005，28(9):827-828.

［5］李開志，雷灼雨，巴國際.RP—HPLC法測定靈芝膠囊中腺苷的含量［J］.中國藥房，2007，18(30):2371-2372.

［6］李 軍，任孝德，魏晨陽.HPLC法測定靈芝膠囊中腺苷的含量［J］.中醫(yī)研究，2008，21(9):91-92.

［7］嚴(yán) 華，張聿梅，宋金翠，等.靈芝膠囊中腺苷、腺嘌呤的TCL鑒別及腺苷的HPLC法含量測定［J］.藥物分析雜志，2008，28(11):1800-1803.

［8］胡文璐，余 俊，黃宗雯.反相HPLC法測定靈芝膠囊中腺苷的含量［J］.黑龍江醫(yī)藥，2009，22(5):599-601.