周燕園

（桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004）

墨旱蓮為菊科植物鱧腸Eclipta prostrata L.的干燥地上部分，又名旱蓮草、鱧腸草、金陵草等，性寒，味甘、酸，入肝、腎經(jīng)。具有滋肝補(bǔ)腎、涼血止血之功效。主治牙齒松動(dòng)，須發(fā)早白，眩暈耳鳴，腰膝酸軟，陰虛血熱，吐血，衄血，尿血，血痢，崩漏下血，外傷出血［1-2］。墨旱蓮配方顆粒是墨旱蓮飲片經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒等工序制成的單味中藥配方顆粒劑，單味中藥配方顆粒和傳統(tǒng)的水煎劑具有基本相同的有效成分、療效和藥理作用，其性味、歸經(jīng)、功效、成分與原中藥飲片基本一致［3-5］。據(jù)報(bào)道［6-11］，墨旱蓮含有三萜類，黃酮類，生物堿類，噻吩類，蟛其菊內(nèi)酯類，有機(jī)酸類等成分，綠原酸和咖啡酸是墨旱蓮藥材及其中成藥制劑中的有效成分，綠原酸具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降糖等作用，咖啡酸具有抗蛇毒、抗菌、抗病毒、止血等作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，墨旱蓮具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等藥理作用與有機(jī)酸類成分有一定相關(guān)性。而且，2010年版《中國(guó)藥典》僅有墨旱蓮藥材和飲片的定量測(cè)定，并未對(duì)墨旱蓮配方顆粒有相應(yīng)的規(guī)定。因此，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相法［12-13］測(cè)定墨旱蓮配方顆粒中的綠原酸和咖啡酸，方法簡(jiǎn)便可行、快速，可用于控制產(chǎn)品質(zhì)量。

1 儀器及試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 Series高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)(包括在線脫氣、四元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器、Hp-Chemstation)，Agilent 8453紫外-可見分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫公司)，BP211D電子分析天平(德國(guó)賽多利斯)，Simplicity 185超純水系統(tǒng)(美國(guó) MILLIPORE公司)，SB3200-T超聲清洗器(上海必能信有限公司)，LG16-W離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，SHZ-D循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。

1.2 試藥 綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110753-200413，純度98.7%)，咖啡酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110885-200102，純度99.1%)，墨旱蓮配方顆粒(江陰天江藥業(yè)有限公司，批號(hào):907222，903055，1003064，規(guī)格:每包1 g，相當(dāng)于10 g藥材飲片)，甲醇、乙腈為色譜純(Fisher公司)，HPLC用水為超純水，其他試劑為分析純，均經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)后使用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇 －0.1%磷酸水溶液(15∶85)；體積流量 1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng) 327 nm；柱溫35℃。

圖1 混合對(duì)照品(A)和墨旱蓮配方顆粒樣品(B)HPLC圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸和咖啡酸對(duì)照品各8.05、7.37 mg，分別用甲醇定容至25 mL，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取墨旱蓮配方顆粒1 g，置具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇15 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理60 min，放冷，補(bǔ)質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，離心，作為供試品溶液。

2.3 供試品處理的正交試驗(yàn)

2.3.1 因素水平的確定 根據(jù)墨旱蓮配方顆?；钚猿煞值男再|(zhì)及初步預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，采用L9(34)正交試驗(yàn)安排墨旱蓮配方顆粒的提取工藝，以綠原酸和咖啡酸作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇含甲醇量、溶劑體積、超聲提取時(shí)間3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，因素水平見表1。

表1 提取工藝因素水平

2.3.2 正交試驗(yàn)方法 精密稱取墨旱蓮配方顆粒1 g于50 mL具塞錐形瓶中，分別按正交因素表制備各樣品，稱定，提取后取出，冷卻后補(bǔ)回原質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，離心，備用。

2.3.3 綠原酸和咖啡酸測(cè)定 分別吸取上述各樣品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，依法測(cè)定綠原酸和咖啡酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見表2，方差分析見表3。

2.3.4 最佳提取工藝的確定 由表2可知，比較極差可直觀看出，因素C的極差最小，數(shù)據(jù)處理時(shí)作為最小誤差項(xiàng)。由表2和表3可知，各因素對(duì)提取墨旱蓮配方顆粒中綠原酸和咖啡酸的影響程度依次為:A＞B＞C，因素A有顯著性差異，即含甲醇量對(duì)提取率有顯著性影響。因此，對(duì)綠原酸和咖啡酸提取的最佳工藝組合為A1B2C3，即選用50%甲醇溶劑15倍量，超聲處理60 min。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(n=3)

表3 方差分析

2.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)墨旱蓮配方顆粒3份(批號(hào):0907222)，每份1 g，按照最佳工藝A1B2C3進(jìn)行超聲提取，并按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以2.1項(xiàng)色譜條件精密吸取10 μL進(jìn)樣分析。結(jié)果綠原酸和咖啡酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.8086、0.2882 mg/g，平均總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0968 mg/g，表明本方法的提取效果較好。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液1、2.5、5、7.5 mL分別定量至10 mL量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，制成不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，各精密吸取所得質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)液及原質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)液10 μL，注入液相色譜儀中，按照上述色譜條件測(cè)定峰面積積分值。以綠原酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，求得回歸方程為Y=31791.7071X+20.897821，r=0.99995，結(jié)果表明，綠原酸在0.0322～0.322 mg/mL之間呈良好線性關(guān)系。

精密量取咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)液0.3、2、4、6、8mL分別定量至10 mL量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，制成不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，各精密吸取所得質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)液10 μL，注入液相色譜儀中，按照上述色譜條件測(cè)定峰面積積分值。以咖啡酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，求得回歸方程為Y=74105.14X+6.0353423，r=0.99996，結(jié)果表明，咖啡酸在0.008844～0.23584 mg/mL之間呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取混合對(duì)照品溶液(綠原酸質(zhì)量濃度:0.0547 mg/mL，咖啡酸質(zhì)量濃度:0.0191mg/mL)10 μL，按上述2.1項(xiàng)色譜條件，進(jìn)樣，平行測(cè)定5次，計(jì)算，結(jié)果綠原酸、咖啡酸峰面積的RSD值分別為0.74%和0.41%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)供試品6份(批號(hào):0907222)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果綠原酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8168 mg/g，RSD為1.72%，咖啡酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2872 mg/g，RSD為1.61%，表明本法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)供試品(批號(hào):0907222)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以2.1項(xiàng)色譜條件分別在0、2、6、12、18、24 h 進(jìn)樣 10 μL，測(cè)定綠原酸、咖啡酸峰面積，RSD分別為1.63%、1.52%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 取同一批(批號(hào):0907222)已知量的供試品6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入對(duì)照品的50%甲醇溶液(綠原酸質(zhì)量濃度為0.082 mg/mL，咖啡酸質(zhì)量濃度為0.028 mg/mL)5 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定綠原酸、咖啡酸。結(jié)果綠原酸的平均回收率為101.60%，RSD為1.94%，咖啡酸的平均回收率為102.62%，RSD為1.27%，表明本法準(zhǔn)確度較好。見表4。

2.9 不同批號(hào)樣品的測(cè)定 按2.2.2項(xiàng)下方法和2.1項(xiàng)色譜條件，對(duì)3批的墨旱蓮配方顆粒進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。

表4 加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

表5 樣品中綠原酸和咖啡酸測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

采用正交試驗(yàn)法對(duì)樣品的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了采用50%甲醇15倍量為提取溶液，超聲提取60 min的樣品前處理方法。

流動(dòng)相的pH對(duì)分離有較大的影響，因?yàn)榫G原酸、咖啡酸具有羧酸結(jié)構(gòu)，呈酸性，以甲醇-水(15∶85)為流動(dòng)相時(shí)拖尾較嚴(yán)重，改用甲醇－0.1%磷酸溶液(15∶85)，結(jié)果供試品色譜中綠原酸和咖啡酸得到了良好的分離。

用二極管陣列檢測(cè)器分析比較了綠原酸和咖啡酸對(duì)照品色譜峰和樣品中所測(cè)成分相應(yīng)色譜峰的紫外吸收光譜，綠原酸、咖啡酸在327 nm波長(zhǎng)下均有較強(qiáng)吸收，與文獻(xiàn)［12-13］報(bào)道相同，并且檢測(cè)靈敏度較高，對(duì)同時(shí)測(cè)定綠原酸和咖啡酸較為適宜，因此選用327 nm波長(zhǎng)檢測(cè)。

不同批號(hào)樣品測(cè)定結(jié)果表明，同一廠家不同批號(hào)墨旱蓮配方顆粒中指標(biāo)成分綠原酸和咖啡酸存在一定差異，這可能與墨旱蓮的采收季節(jié)，來(lái)源及加工過(guò)程有關(guān)。而色譜圖中的其他成分有待進(jìn)一步研究，以便為墨旱蓮配方顆粒制定較全面的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

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