王申?yáng)|， 陳培麗， 胡 斯， 李江奇， 孟琳懿

（上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，上海 200040）

麥芪益肺合劑是我院自制中藥制劑。由麥冬、黃芪、陳皮、烏梅、白術(shù)、五味子等八味藥材組成，用于治療小兒呼吸道反復(fù)感染，應(yīng)用于臨床30余年，療效確切，安全性好。已對(duì)處方中君藥黃芪制定了黃芪甲苷定量測(cè)定［1］，此次對(duì)本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做進(jìn)一步提高。處方中陳皮能行散肺氣壅遏，用于痰多咳嗽等癥［2-3］。所含主要成分橙皮苷已證明具有較多的生理活性［4］，與陳皮的藥理作用息息相關(guān)。因此本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)陳皮中主要成分橙皮苷進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)研究白術(shù)［5］、烏梅［6］、五味子［7］的有效成分，分別建立TLC鑒別方法，得到的色譜斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無(wú)干擾。提高后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可有效地控制本品質(zhì)量，保證臨床療效。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀(紫外檢測(cè)儀)；MERCK G60及 GF254薄層板；Sartorius BP211D天平；BRANSON B5500S-MT超聲儀；橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)110721-200613)、五味子甲素對(duì)照品(批號(hào)110764-200107)、熊果酸對(duì)照品(批號(hào)110742-9908)、白術(shù)對(duì)照藥材(批號(hào)120925-200206)、五味子對(duì)照藥材(批號(hào)120922-200304)、烏梅對(duì)照藥材(批號(hào)121208-0101)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；甲醇為色譜純，其他試劑為分析純，水為超純水。麥芪益肺合劑由上海市兒童醫(yī)院提供。

2 薄層鑒別

2.1 白術(shù)的薄層鑒別［2，8-9］取本品25 mL，加正己烷20 mL振搖提取，正己烷液低溫?fù)]干，殘?jiān)诱和? mL使溶解，作為供試品溶液。同時(shí)制備不含白術(shù)的陰性制劑，同法制成陰性對(duì)照溶液。取白術(shù)對(duì)照藥材0.25 g，加正己烷20 mL，超聲處理15 min，濾過(guò)，濾液作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)(中國(guó)藥典2010年版一部附錄VI B)，吸取上述溶液各20 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(5∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)、取出、晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性制劑無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 白術(shù)薄層鑒別色譜圖

2.2 烏梅的薄層鑒別［2，10-11］取本品25 mL，加甲醇30 mL，超聲處理 30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)檬兔?30～60℃)浸泡兩次，每次2 min，每次15 mL，傾去石油醚，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。同時(shí)制備不含烏梅的陰性制劑，同法制成陰性對(duì)照溶液。另取烏梅對(duì)照藥材4 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取熊果酸對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成每1 mL含0.4 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)(中國(guó)藥典2010年版一部附錄Ⅵ B)，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(20∶5∶8∶0.1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)、取出、晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液(v/v)，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性制劑無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

圖2 烏梅薄層鑒別色譜圖

2.3 五味子的薄層鑒別［2，12-13］取本品20 mL，加三氯甲烷20 mL，搖勻，加熱回流30 min，取三氯甲烷液蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。同時(shí)制備不含五味子的陰性制劑，同法制成陰性對(duì)照溶液。另取五味子對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取五味子甲素對(duì)照品，加三氯甲烷制成1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)(中國(guó)藥典2010年版一部附錄Ⅵ B)，吸取上述溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-乙酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)、取出、晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性制劑無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

圖3 五味子薄層鑒別色譜圖

3 定量測(cè)定

3.1 色譜條件 Agileng XDB-C18色譜柱(5 μm，150 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相為甲醇-水-乙酸(25∶71∶4)；體積流量1 mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm；進(jìn)樣量10 μL。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.128 mg的溶液，作為對(duì)照品貯備溶液，分別精密吸取對(duì)照品貯備溶液 2、4、6、8、10 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣量(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 A=2969.13C－16.29(r=0.9999)，橙皮苷在0.256～1.28 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

3.3 供試品溶液制備 精密量取供試品溶液20 mL置于分液漏斗中，加乙醚20 mL振搖提取，棄去乙醚液，水液再用乙酸乙酯提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，?0 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

3.4 干擾性試驗(yàn) 取不含陳皮的陰性制劑，按樣品溶液制備項(xiàng)下的方法處理，進(jìn)樣。結(jié)果，陰性制劑在橙皮苷對(duì)照品色譜峰處無(wú)干擾峰出現(xiàn)，表明處方中其它成分對(duì)測(cè)定無(wú)影響。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 HPLC色譜圖

3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，以橙皮苷峰面積計(jì)RSD為0.47%。表明儀器精密度良好。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液，分別在0、2、4、8、16.5、24.5 h測(cè)定，RSD 為0.56%。

3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品6份，按供試品溶液制備項(xiàng)下的方法處理，測(cè)定，橙皮苷質(zhì)量濃度為0.09492 mg/mL，RSD為1.31%。

3.8 回收率試驗(yàn) 精密量取樣品10 mL，分別精密加入質(zhì)量濃度為0.328 mg/mL的橙皮苷溶液2.5、3.0、3.5 mL，分別平行處理3份，按供試品溶液制備項(xiàng)下的方法處理，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液測(cè)定。計(jì)算加樣回收率，結(jié)果橙皮苷的平均回收率為99.1%，RSD為2.64%。

3.9 樣品測(cè)定 取3批自制樣品(批號(hào)為110320、110324和110328)，依法測(cè)定，計(jì)算橙皮苷的質(zhì)量濃度分別為0.1064、0.1048、0.0950 mg/mL。

4 討論

4.1 在制定白術(shù)、烏梅、五味子的TLC方法時(shí)，發(fā)現(xiàn)由于本品為水煎液，成分較復(fù)雜，基質(zhì)干擾較嚴(yán)重，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，選擇合適的提取方法及展開(kāi)劑，使得基質(zhì)干擾消除；得到的色譜斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無(wú)干擾，方法專屬性較強(qiáng)。

4.2 陳皮中橙皮苷的測(cè)定方法較多［14-17］，經(jīng)過(guò)比較，選擇了應(yīng)用較廣的HPLC法對(duì)本品中橙皮苷進(jìn)行了測(cè)定；同時(shí)對(duì)流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了摸索，經(jīng)對(duì)乙腈-磷酸系統(tǒng)及甲醇-乙酸(冰醋酸)系統(tǒng)分別考察，發(fā)現(xiàn)甲醇-乙酸系統(tǒng)更有利于本品中橙皮苷與其他成分的分離。

4.3 常用的橙皮苷提取方法為先石油醚去雜再用甲醇提取，或采用甲醇直接提取。本品為水煎液，且所含成分較多，對(duì)橙皮苷的測(cè)定造成了較大的干擾，通過(guò)摸索，現(xiàn)采用乙醚去除雜質(zhì)后再用乙酸乙酯提取的方法，使得供試品色譜中橙皮苷與其他成分得到有效分離，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

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