韓桂茹， 張 鵬， 安麗娜， 申玉龍

（1.河北省藥品檢驗所，河北 石家莊 050011；2.承德燕峰藥業(yè)有限責(zé)任公司，河北 承德 067600）

復(fù)方鹿仙草片為地標(biāo)升國標(biāo)的品種復(fù)方鹿仙草顆粒［1］［標(biāo)準(zhǔn)號:WS-10461(ZD-0461)-2002］的改劑型產(chǎn)品，原標(biāo)準(zhǔn)［2］收載了苦參、土茯苓、天花粉的薄層鑒別，氧化苦參堿的定量測定。不論薄層鑒別和定量測定，其樣品的前處理都比較麻煩，導(dǎo)致重復(fù)性比較差，最為關(guān)鍵的是只對氧化苦參堿進(jìn)行了測定，從目前的文獻(xiàn)［3］得知，苦參堿和氧化苦參堿都是有效成分，并存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，在苦參藥材中幾乎都是以氧化苦參堿的形式存在，但在制劑中，因含還原性成分或受熱時間長，都會使氧化苦參堿減少，苦參堿增多，所以只測定一種成分，無法有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。為此，對復(fù)方鹿仙草片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)重新進(jìn)行了簡化和提高研究，報道如下。

1 材料、儀器與試藥

1.1 材料 復(fù)方鹿仙草片(批號:10945001、10945002、10945003)及處方中藥材由承德燕峰藥業(yè)股份有限公司提供；對照藥材:苦參(批號:121019-200304)、土茯苓(批號:121439-200401)、天花粉(批號:121361-200401)，對照品:咖啡酸(批號:110885-200102)苦參堿(批號:110736-200934)、氧化苦參堿(批號:110780-200506)購自中國藥品生物制品檢定所。九香蟲和黃藥子由河北省醫(yī)院藥劑科陳太平主任藥師，分別鑒定為蝽科昆蟲九香蟲Aspongopus chinensis Dallas的干燥體和薯蕷科植物黃獨Dioscorea bulbifera L.的干燥塊莖。

1.2 儀器 日本島津液相色譜儀:配有LC-20AT泵；SPD-M20A二極管陣列檢測器；LC-solution色譜工作站；色譜柱:迪馬 dimonsil色譜柱(5 μm，4.6 mm ×150 mm)。

1.3 試劑、試藥 流動相所用的乙腈、甲醇為色譜純，其它試劑、試藥均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 苦參的薄層鑒別 取本品10片，除去包衣，研細(xì)，稱取2.0 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取苦參對照藥材0.3 g，加甲醇3 mL，超聲處理10 min，上清液作為對照藥材溶液。再取苦參堿對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg溶液，作為對照品溶液。吸取對照藥材和對照品溶液各5 μL、供試品溶液10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-濃氨(10∶2∶2.5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對照藥材與對照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色斑點。經(jīng)空白驗證，空白樣品(不含苦參的樣品)無干擾(見圖1)。

圖1 樣品中苦參TLC圖Fig.1 TLC chromatogram of Sophorae flavescenttis Radix in sample

2.1.2 鹿仙草與土茯苓的薄層鑒別 取土茯苓對照藥材0.5 g，加乙醇10 mL，回流提取15 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為土茯苓對照藥材溶液。另取鹿仙草對照藥材0.5 g，加甲醇3 mL，超聲處理10 min，上清液作為鹿仙草對照藥材溶液。再取咖啡酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取對照品溶液3 ～5 μL、對照藥材溶液 8 ～10 μL、2.1.1 項下供試品溶液5～6μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(7∶3∶0.4)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照品和鹿仙草對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色主斑點；再噴以1%磷鉬酸無水乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照藥材與對照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色主斑點。經(jīng)空白驗證，空白樣品(不含鹿仙草或土茯苓的樣品)無干擾(見圖2-A，圖2-B)。

2.1.3 為九香蟲的薄層鑒別 取九香蟲對照藥材0.3 g，加甲醇3 mL，超聲處理10 min，上清液作為對照藥材溶液。吸取對照藥材溶液與2.1.1項下的供試品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-濃氨(4∶1∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色熒光主斑點。經(jīng)空白驗證，空白樣品(不含九香蟲的樣品)無干擾(見圖3)。

圖2-A 樣品中咖啡酸和鹿仙草TLC圖 圖2-B 樣品中土茯苓、鹿仙草TLC圖Fig.2-A TLC chromatogram of caffeic acid and Balanophorae Herba in sampleFig.2-B TLC chromatogram of Smilacis glabrae Rhizoma and Balanophorae Herba in sample

圖3 樣品中九香蟲TLC圖Fig.3 TLC chromatogram of Aspongopus in sample

2.1.4 為黃藥子的薄層鑒別 取黃藥子對照藥材0.5 g，加水 30 mL，煎煮 20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2mL使溶解，作為對照藥材溶液。吸取對照藥材溶液與2.1.1項下的供試品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-濃氨(10∶2∶2.5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與黃藥子對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點。經(jīng)空白驗證，空白樣品(不含黃藥子的樣品)無干擾(見圖4)。

2.1.5 為天花粉的薄層鑒別 取本品細(xì)粉0.3 g，加40%甲醇5 mL，超聲處理5 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取天花粉對照藥材0.3 g，加40%甲醇5 mL，超聲處理10 min，上清液作為對照藥材溶液。吸取對照藥材溶液和供試品溶液各3～5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-無水乙醇-冰醋酸-水(8∶2∶2∶3)為展開劑，展開，取出，熱風(fēng)吹干，噴以2%磷鉬酸無水乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點。經(jīng)空白驗證，空白樣品(不含天花粉的樣品)無干擾(見圖5)。

圖4 樣品中黃藥子TLC圖Fig.4 TLC chromatogram of Dioscoreae-Bulbifeerae Rhizoma in sample

圖5 樣品中天花粉TLC圖Fig.5 TLC chromatogram of Trichosanthis Radix in sample

2.2 苦參堿和氧化苦參堿測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為乙腈-甲醇－0.1%磷酸 (1.5∶4∶94.5)；檢測波長210 nm；柱溫40℃；體積流量1.0 mL/min；理論板數(shù)按氧化苦參堿峰計算應(yīng)不低于2000。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的苦參堿和氧化苦參堿對照品適量，加流動相制成每1 mL含苦參堿和氧化苦參堿各15 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)15 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液3 mL，置中性氧化鋁柱(φ1 cm，100～120目中性氧化鋁2.5 g)上，用70%甲醇洗脫至10 mL量瓶中至約9 mL，加1滴磷酸，用70%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。即得。

2.2.4 樣品的測定 取供試品，按供試品制備及色譜條件項下，進(jìn)行提取，制備，進(jìn)樣10 μL，以外標(biāo)二點法計算含有量，結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方鹿仙草片中苦參堿和氧化苦參堿測定結(jié)果(n=3)Tab.1 Contents of matrine and oxymatrine in Compound Luxiancao Tablet(n=3)

2.2.5 測定波長的選擇 采用日本島津液相色譜儀；LC-20AT泵；SPD-M20A二極管陣列檢測器；LC-solution色譜工作站，對苦參堿和氧化苦參堿對照品以及復(fù)方鹿仙草片中相應(yīng)色譜峰分別進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果表明:苦參堿和氧化苦參堿光譜圖相似，其最大吸收都在(205±2)nm附近，且對照品和供試品波峰基本一致，采用210 nm為測定波長。

2.2.6 線性范圍 取每1 mL含0.0435 mg和0.2175 mg的苦參堿對照品溶液，分別進(jìn)樣1、2、5、10 μL 和3、5 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:苦參堿進(jìn)樣量在0.0435～1.0875 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為:Y=1652490 X+3517，r=0.99997。再取每1 mL含0.0515 mg和0.3892 mg的氧化苦參堿對照品溶液，分別進(jìn)樣 1、2、5、10、15 μL 和 3 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:氧化苦參堿進(jìn)樣量在0.0515～1.946 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為:Y=1445790X －1324，r=0.999999。

2.2.7 精密度實驗 取苦參堿和氧化苦參堿對照品與相應(yīng)的供試品溶液，各進(jìn)樣5次，每次10 μL，對照品5次測定的峰面積平均值，苦參堿為398810，RSD為 0.56%，氧化苦參堿為 364976，RSD為0.47%；供試品中苦參堿的平均值為317035，RSD為0.13%，氧化苦參堿的為292002，RSD為0.21%。說明精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取精密度試驗項下的對照品溶液與供試品溶液，繼續(xù)每隔一定時間，向高效液相色譜儀注入一針，考察了24 h內(nèi)的穩(wěn)定性，其RSD:對照品苦參堿的為0.59%，氧化苦參堿的為0.58%；供試品中苦參堿的為0.36%，氧化苦參堿的為0.32%。說明對照品與供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗 以高(120%)、中(100%)、低劑量(80%)，取同一批樣品(批號:10945001)9份，按供試品制備及色譜條件項下，制備樣品溶液，進(jìn)行測定。同批樣品9次測定的結(jié)果，苦參堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.76 mg/g，RSD為1.40%；氧化苦參堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.80 mg/g，RSD為2.06%；二者之和的質(zhì)量分?jǐn)?shù)含量為3.56 mg/g，RSD為1.58%。說明方法重復(fù)性良好。

2.2.10 回收率試驗 采用加樣回收試驗。取已測定的同一批樣品9份(批號:10945001)每份0.24 g，精密稱定，按高、中、低劑量，加上相應(yīng)的對照品，按供試品測定項下，制備樣品溶液，進(jìn)行測定，計算回收率。苦參堿的平均回收率為99.09%(n=9)，RSD為1.39%(見表2)；氧化苦參堿的平均回收率為100.18%(n=9)，RSD為2.08%(見表3)。

2.2.11 定量測定專屬性試驗 取苦參堿和氧化苦參堿對照品溶液、復(fù)方鹿仙草片供試品溶液與空白溶液(處方中不加苦參的樣品)，分別采用正文項下的測定條件，進(jìn)行HPLC色譜測定。樣品與苦參堿和氧化苦參堿對照品在同一保留時間有相同的波峰出現(xiàn)，而空白溶液則無相應(yīng)的峰，證明空白樣品不干擾測定，定量測定專屬(見圖6～8)。

3 討論

3.1 苦參主含苦參堿和氧化苦參堿，具抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗心率失常，鎮(zhèn)咳，殺菌等廣泛的生物活性。其定量測定，有薄層掃描法，毛細(xì)管電泳法，高效液相法等，最常用的是高效液相法。但存在三大弊端:第一，不論藥材［4-5］還是制劑［6-7］，前處理方法都比較繁瑣、復(fù)雜，需用三氯甲烷等毒害溶劑純化處理，費時長，成本高、效率低、污染環(huán)境，危害健康，并直接影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。第二，反相色譜的流動相多是緩沖鹽中添加十二烷基硫酸鈉［8］或三乙胺［9］等，溶質(zhì)增多，比重增大，壓力增高，稍不注意就會損傷儀器和色譜柱，最為關(guān)鍵的是苦參堿或氧化苦參堿多不能用同一流動相同時測定，即便有進(jìn)行同時測定［10］的二者的保留時間，相差在16 min以上，每測定一針需花費50 min。第三，采用正相色譜［11-12］，必須是特定的氨基柱，其流動相中的有機相要達(dá)90%以上，測定成本升高，柱壽命縮短。

表2 樣品中苦參堿的回收率試驗結(jié)果Tab.2 Results of recovery test for matrine in sample

表3 樣品中氧化苦參堿的回收率試驗結(jié)果Tab.3 Results of recovery test for oxymatrine in sample

圖6 對照品HPLC色譜圖1.苦參堿2.氧化苦參堿Fig.6 HPLC chromatogram of reference substance 1.matrine 2.oxymatrine

圖7 復(fù)方鹿仙草片HPLC色譜圖1.苦參堿2.氧化苦參堿Fig.7 HPLC chromatogram of Compound Luxiancao Tablet 1.matrine 2.oxymatrine

圖8 空白樣品HPLC色譜圖Fig.8 HPLC chromatogram of negative sample

3.2 本研究采用含水甲醇提取樣品后，吸取一定量，氧化鋁柱除雜，含水甲醇洗脫，濾過，續(xù)濾液進(jìn)樣的程序，取代了原方法的氨試液堿化，三氯甲烷提取、中性氧化鋁柱除雜，三氯甲烷與三氯甲烷-甲醇(7∶3)洗脫，洗脫液蒸干，定容，濾過，濾液進(jìn)樣的程序。做到了樣品處理程序無濃縮、無蒸干、無萃取，簡便、快捷、省時、省能源、有效提高了工作效率與方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。最為關(guān)鍵的是:采用普通的反相色譜柱，非緩沖鹽體系，進(jìn)行了復(fù)方鹿仙草片中苦參堿和氧化苦參堿的同時定量測定，生物堿波峰分離良好，色譜柱耐用性廣。

3.3 簡化和提高后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，實現(xiàn)了處方中的味味藥材有鑒別，主藥中的兩種生物堿有定量測定，有效提高了質(zhì)量檢測內(nèi)容。而且完成六味藥材的鑒別，只需樣品2.3 g，薄層板5塊，提取溶劑35 mL，展開劑50 mL，時間2 h；完成定量測定只需樣品0.8 g，前處理時間1.5 h，溶劑35 mL。與原標(biāo)準(zhǔn)相比，在增加3項薄層鑒別和一項定量測定指標(biāo)的情況下，還比原標(biāo)準(zhǔn)節(jié)約有機溶劑420 mL，時間12 h。該研究內(nèi)容無疑是今后中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展方向。

3.4 本制劑還參照中國藥典2010年版一部苦參與文獻(xiàn)［12］項下的測定條件，采用waters氨基酸高效液相色譜柱，以乙腈-無水乙醇－3%磷酸(81∶9.5∶9.5)為流動相，進(jìn)行了測定。結(jié)果顯示，流動相平衡所需時間長，在平衡過程中正負(fù)波動幅度太大。測定時對照品有倒峰出現(xiàn)，苦參堿和氧化苦參堿對照品前端呈現(xiàn)了3個類似于甲醇的溶劑峰，樣品溶液中的苦參堿峰與雜質(zhì)不能分離，且苦參堿的保留時間也與對照品不一致。流動相條件比較苛刻，酸度稍有變化，即由3%變?yōu)?.9%，樣品溶液就無法分離。不僅如此，流動相中有機相達(dá)90%以上，不但測定成本為本方法的16倍以上，而且測定結(jié)束后，色譜柱很難用甲醇沖洗干凈，降低了色譜柱的使用壽命。

［1］國家藥品監(jiān)督管理局編.Ws-10461(ZD-0461)2002:國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編，口腔 腫瘤 兒科分冊［S］2002:365.

［2］YBZ 06102009國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)［S］.

［3］賈敏鴿，孫文基.苦參及其復(fù)方制劑中苦參堿和氧化苦參堿的轉(zhuǎn)化研究［J］.藥物分析雜志，2003，23(2):90.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:188-189.

［5］游貴君，姜建偉.HPLC法測定苦參不同炮制品中苦參堿和氧化苦參堿的含量［J］.福建中醫(yī)藥，2008，39(3):51-52.

［6］馮紹華.HPLC法測定康婦靈片中苦參堿和氧化苦參堿的含量［J］.北方藥學(xué)，2008，5(4):3-5.

［7］陳大中，趙潤琴.高效液相色譜法測定艾愈片中苦參堿和氧化苦參堿的含量［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2008，14(3):20-21.

［8］朱良輝，陳 標(biāo)，汪 軍.高效液相法測定復(fù)方鹿仙草膠囊中氧化苦參堿的含量［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，18(6):24.

［9］鄧開鋒，吳俊偉，唐建華.HPLC測定苦參注射液中苦參堿含量［J］.中國獸藥雜志，2010，44(11):36-38.

［10］張 利，魏玉梅，曹兆君，等.HPLC同時測定當(dāng)歸苦參丸中苦參堿和氧化苦參堿的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2008，23(4):199-200.

［11］靳如義，廖雪梅，羅忠圣，等.HPLC法測定苦參總堿中苦參堿和氧化苦參堿的含量［J］.藥物分析雜志，2008，28(2):297-299.

［12］耿家玲，柴文英.復(fù)方鹿仙草顆粒含量測定方法研究［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2009，30(7):55-56.