劉 萍，徐 彬，劉 平，張 志，李建平，張 立，蘇 浩

(1.安徽醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，合肥 230601;2.合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科，合肥 230009;3.安徽省立醫(yī)院心內(nèi)科，合肥 230001)

近年來(lái)，我國(guó)急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人民生命健康。AMI屬于多基因遺傳性疾病，且是環(huán)境與多種遺傳因素相互作用的結(jié)果。血小板膜糖蛋白(GP)是血小板發(fā)揮黏附和聚集功能的主要成分，受GPⅠa-807基因的多態(tài)性的影響，在血栓形成及止血過(guò)程中起到重要作用［1］。本研究通過(guò)檢測(cè)安徽地區(qū)漢族人中AMI患者及健康對(duì)照者的血小板膜糖蛋白(GP)受體Ⅰa C807T基因多態(tài)性，明確血小板GPⅠa C807T的基因型，探討其多態(tài)性與老年人AMI發(fā)病的關(guān)系，分析GPⅠa-807等位基因型是否為漢族人AMI發(fā)病的危險(xiǎn)因素，以及與冠心病發(fā)病的是否存在相關(guān)性，以期對(duì)預(yù)防該病提供臨床資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2009年1月—2011年12月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、省立醫(yī)院和新安醫(yī)院心內(nèi)科收集AMI患者為實(shí)驗(yàn)組(74例)，其中男51例，女23例;均符合WHO心肌梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn);年齡47～79歲，平均年齡(64.8±9.2)歲。以同期門(mén)診體檢健康者為對(duì)照組(60例)，其中男41例，女19例;年齡 46～74歲，平均年齡(59.2±7.8)歲。兩組在年齡、性別構(gòu)成、血脂水平及吸煙量方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 取AMI患者和健康者外周靜脈血2 ml，于EDTA-2Na抗凝管中，用全血基因組DNA抽提試劑盒(購(gòu)自上海生物工程有限公司)提取DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 檢測(cè)方法 使用PCR技術(shù)擴(kuò)增外周血基因組DNA，其引物見(jiàn)表1。擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度約為184 bp，引物均由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)體系如下:在EP管中，加入以下試劑，使終末濃度分別為 1 × buf，MgC122.8 mmol/L，dNTP200 μmol/L，引物 0.25 pmol/μl，基因組 DNA400 ng，Taq 酶 2 U，總體積達(dá) 50 μl，上面覆蓋 40 μl石臘油。

表1 擴(kuò)增外周血基因組DNA引物

PCR擴(kuò)增程序如下:先95℃變性3 min，35個(gè)循環(huán)，93℃變性 50 s，55℃退火 50 s，72℃延伸1 min，最后72℃再延長(zhǎng)20 min。用1×TBE緩沖液進(jìn)行電泳，在100 V下電泳約30 min，至點(diǎn)樣液在凝膠上行進(jìn)2/3處停止電泳。在紫外透射儀下觀察結(jié)果，通過(guò)PCR產(chǎn)物的條帶與DNA Marker的對(duì)比分析，當(dāng) P1、P2出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，基因型為 GPⅠa807nt CC;僅P1、P3有擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，GPⅠa基因型為807nt TT;當(dāng)P1、P2和P1、P3均有擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，基因型為GPⅠa807nt TC。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)各項(xiàng)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組GPⅠa 807nt的基因型及等位基因型分析:PCR擴(kuò)增后GPⅠa的基因產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，產(chǎn)物為184 bp的片段，符合目的片段的大小。

在74例AMI患者中，GPⅠa基因807nt C等位基因出現(xiàn)的頻數(shù)為73，T等位基因出現(xiàn)的頻數(shù)為77，對(duì)照組中C等位基因出現(xiàn)的頻數(shù)為86，T等位基因出現(xiàn)的頻數(shù)為34(表1)。兩組GPⅠa基因型及等位基因頻率分布實(shí)驗(yàn)組GPⅠa T等位基因攜帶者頻率與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.33，P ＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組GPIa-807基因C807T多態(tài)性分析

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，TT+TC基因型分布明顯增多(圖1)。實(shí)驗(yàn)組T等位基因出現(xiàn)的頻率也顯著高于對(duì)照組(χ2=7.33，P ＜0.05)(表 2)。由此可見(jiàn)，血小板膜GPⅠa基因C807T多態(tài)性與心肌梗死有關(guān)聯(lián)性。

圖1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組GPⅠa 807nt基因型比較

3 討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)GP基因多態(tài)性與AMI關(guān)系的研究也越來(lái)越深入。同時(shí)高血壓、高血脂、吸煙和糖尿病等也被認(rèn)為是AMI的危險(xiǎn)因素。若能對(duì)以上這些因素的進(jìn)行提早干預(yù)，則能在一定程度上可防止AMI的發(fā)生。

GPⅠa是1條 α2鏈，GPⅡa又稱(chēng)血小板/內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1，是1條 β1鏈，GPⅠa/Ⅱa中，只有GPⅠa 有多態(tài)性［2］。Kunicki等［3］研究發(fā)現(xiàn)，GPⅠa基因的多態(tài)性與GPⅠa-Ⅱa表達(dá)水平均有相關(guān)性。攜帶T等位基因的個(gè)體，GPⅠa-Ⅱa表達(dá)水平高;反之，攜帶C等位基因個(gè)體，GPⅠa-Ⅱa表達(dá)水平低。GPⅠa-Ⅱa能引起血小板的黏附和聚集，在血栓形成及止血過(guò)程中起到重要作用［4］。

本研究顯示，實(shí)驗(yàn)組的患者年齡都較大，提示AMI的發(fā)生與高齡有一定的相關(guān)性。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組TT+TC基因型攜帶者明顯增多，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組T等位基因出現(xiàn)的頻率也有顯著提高，表明GPⅠa C 807T基因多態(tài)性與AMI有相關(guān)性。Douglas等［5］認(rèn)為T(mén)T純合子是心肌梗死的重要原因，CC基因型不是AMl發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而TT+TC基因型的高表達(dá)可能是AMI的一個(gè)遺傳性危險(xiǎn)因素。

AMI是由多因素相互作用引起的復(fù)雜性疾病。臨床環(huán)境下，不同AMI患者的臨床結(jié)果以及藥物療效的差異均提示血小板受體GPⅠa的基因多態(tài)性可能與AMI的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。Antoniades等［6］指出GPⅠa基因807nt多態(tài)性與老年人AMI的發(fā)病有相關(guān)性，是對(duì)心肌梗死急性期和心肌梗死人群發(fā)病后Ⅰa發(fā)生變異的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子［6］。

本研究只對(duì)一個(gè)地區(qū)漢族人群GPⅠa-807T基因型和AMI的關(guān)系進(jìn)行分析，無(wú)法控制基因和環(huán)境相互作用這一潛在的混雜因素，因此還需在不同人種和不同人群的大量患者中進(jìn)行進(jìn)一步研究，為AMI發(fā)病的遺傳性因素的早期發(fā)現(xiàn)提供更充分的依據(jù)，以便對(duì)高?；颊吆陀羞z傳性AMI發(fā)病的人群進(jìn)行早期識(shí)別和干預(yù)。

［1］江 雁.血小板膜糖蛋白及其多態(tài)性的研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2003，7(4):281-283.

［2］陳 赟.血小板膜糖蛋白與血栓性疾?。跩］.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，29(3):221-223.

［3］Krupinski J，Kaluza J，Kumar P，et al.Role of angiogenesis in patients with cerebral ischemic stroke［J］.Stroke，1994，25:1794-1798.

［4］楊學(xué)偉，黃 金，周 暢.血小板膜糖蛋白ⅠaC807T基因多態(tài)性與腦梗死急性期血小板功能的關(guān)系［J］.齊魯醫(yī)學(xué)志，2006，21(2):111-113.

［5］Douglas H，Michaelides K，Gorog D A，et al.Platelet membrane glycoproteinⅠbα gene-5T/C Kozak sequence polymorphism as an independent risk factor for the occurrence of coronary thrombosis［J］.Heart，2002，87:70-74.

［6］Antoniades C，Tousoulis D，Vasiliadou C，et al.Genetic polymorphisms of platelet glycoproteinⅠa and the risk for premature myocardial infarction:effects on the release of sCD40L during the acute phase of premature myocardial infarction［J］.J Am Coll Cardiol，2006，47(10):1959-1966.