令 博，田云波，吳洪斌，明 建,3,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子 832000；3.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

微生物發(fā)酵法制取葡萄皮渣膳食纖維的工藝優(yōu)化

令 博1，田云波1，吳洪斌2，明 建1,3,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子 832000；3.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

以釀酒葡萄皮渣為原料，采用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌為發(fā)酵菌種，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量及料液比對(duì)水溶性膳食纖維(SDF)得率的影響為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和均勻試驗(yàn)優(yōu)化微生物發(fā)酵法制取葡萄皮渣膳食纖維的工藝。結(jié)果顯示：發(fā)酵法制取葡萄皮渣膳食纖維的最佳工藝條件為：發(fā)酵溫度40℃、發(fā)酵時(shí)間21h、接種量1%、料液比1:10，在此條件下得到SDF產(chǎn)率為(17.25±0.23)%，所制葡萄皮渣膳食纖維素的膨脹力、持水力和持油力分別為3.38mL/g、4.32g/g和1.87g/g，與原料相比膳食纖維的純度和理化性質(zhì)均得到一定提高。微生物發(fā)酵法制備膳食纖維的同時(shí)能有效提高其品質(zhì)指標(biāo)，是一種較好的高品質(zhì)膳食纖維制備方法。

葡萄皮渣；膳食纖維；發(fā)酵法

葡萄是僅次于柑橘的世界第二大水果，葡萄皮渣(grape pomace，GP)即葡萄經(jīng)釀酒后產(chǎn)生的殘?jiān)饕善咸哑ず推咸炎呀M成，約占其總加工質(zhì)量的20%。長(zhǎng)期以來，GP被用于生產(chǎn)飼料、肥料或者做填埋處理，利用率很低，給生態(tài)環(huán)境也造成了一定破壞[1]。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄皮渣中酚類物質(zhì)(poly-phenolic compounds，PP)含量可達(dá)285～550mg/kg，總膳食纖維(total dietary fiber，TDF)含量可達(dá)干物質(zhì)的70%以上[12]，因此，Saura-Calixo等[3]認(rèn)為葡萄皮渣是一種極具開發(fā)價(jià)值的抗氧化膳食纖維(antioxidant dietary fiber，ADF)資源。

膳食纖維(dietary fiber，DF)通常是指能抗人體小腸的消化吸收而能在大腸被部分或全部發(fā)酵的可食用植物性成分(纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等)、碳水化合物及其類似物質(zhì)的總稱[4]。目前生產(chǎn)DF的原料通常來源于食品加工過程中的下腳料和廢棄物，它們含有大量的水分、灰分、脂肪、淀粉和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，且對(duì)溶性膳食纖維(soluble dietary fiber，SDF)含量較低，因此在制備DF時(shí)首先需通過一定手段去除雜質(zhì)提高DF的純度，其次要增加膳食纖維中對(duì)人體健康發(fā)揮重要作用的SDF的含量改善其生理活性[5]。微生物發(fā)酵法是利用微生物液體發(fā)酵產(chǎn)酶，酶具有一定生物降解和轉(zhuǎn)化作用的原理，使原料中的蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪等雜質(zhì)分解，并使大分子分解成可溶性小分子，提高水溶性膳食纖維的含量。目前的研究多以食品發(fā)酵生產(chǎn)的傳統(tǒng)菌種進(jìn)行，其中以酸奶生產(chǎn)菌種保加利亞乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌最為普遍，它們不僅對(duì)膳食纖維基料中的淀粉、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)具有較強(qiáng)的分解能力，而且安全性較高，因此發(fā)酵法是一種相對(duì)安全、高效、低成本的高品質(zhì)膳食纖維制備和改良方法[6]。本實(shí)驗(yàn)采用上述兩種菌種對(duì)葡萄皮渣進(jìn)行混菌發(fā)酵，以期獲得具有較高純度和品質(zhì)的膳食纖維產(chǎn)品，為釀酒葡萄皮渣的綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

釀酒葡萄皮渣：葡萄品種為赤霞珠，由新疆中基西域葡萄酒公司提供。

葡萄皮渣經(jīng)水洗除雜后烘干，粉碎過60目篩并收集篩下物。以無水乙醚浸泡上述粉體除去脂肪，最后用80%乙醇溶液洗滌殘醚后烘干即為葡萄皮渣原料，密封貯存于陰涼干燥處備用。

保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)以1:1混合的菌種，購(gòu)自哈爾濱美華生物技術(shù)股份有限公司。

脫脂乳粉 內(nèi)蒙古蒙牛實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；白砂糖為食用級(jí)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；TGL-16G型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；JA2003型電子天平 上海精天電子儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；SYQDSX-280A型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵劑的制備[7-8]

由于牛乳和脫脂牛乳是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的最佳培養(yǎng)基，因此當(dāng)菌種要以葡萄皮渣為培養(yǎng)基前，需將葡萄皮渣原料逐步加入脫脂乳以馴化菌種使其適應(yīng)葡萄皮渣培養(yǎng)基，具體方法如下：

菌種→100mL 10g/100mL的脫脂乳中37℃活化2次→50mL10g/100mL的脫脂乳＋50mL葡萄皮渣汁(蒸餾水:葡萄皮渣原料＝50:1，V/m)混合液37℃培養(yǎng)至凝乳2次→10mL10g/100mL的脫脂乳＋90mL葡萄皮渣汁(水:葡萄皮渣＝50:1，V/m)37℃培養(yǎng)至凝乳→發(fā)酵劑(以上菌種馴化過程需控制滅菌條件為105℃, 15min，并于超凈工作臺(tái)中接種)。

1.3.2 發(fā)酵法制備DF

1.3.2.1 DF的制備方法

準(zhǔn)確稱取10.00g葡萄皮渣于錐形瓶中，按一定料液比加入蒸餾水，然后加入皮渣質(zhì)量2%的脫脂乳粉和1%的白砂糖，混合均勻后滅菌。冷卻至室溫后接入一定量的發(fā)酵劑，一定溫度條件下發(fā)酵一定時(shí)間，發(fā)酵結(jié)束后抽濾，濾渣洗至中性后干燥即為水不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber，IDF)，向?yàn)V液中加入4倍體積95%的乙醇沉析后收集濾渣干燥即為SDF，合并上述濾渣即為TDF。以SDF的產(chǎn)率為衡量指標(biāo)優(yōu)化DF的制備工藝條件。

1.3.2.2 DF發(fā)酵工藝條件的單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取葡萄皮渣原料10.00g于250mL錐形瓶中，分別以發(fā)酵過程中的溫度、時(shí)間、接種量和料液比4個(gè)因素作單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)水溶性膳食纖維SDF產(chǎn)率的影響(質(zhì)量為干物質(zhì)質(zhì)量)。

設(shè)定pH值為7.0、發(fā)酵時(shí)間為24h、接種量為1%、料液比1:10，分別選取36、40、44、48℃為不同的發(fā)酵溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后計(jì)算SDF的產(chǎn)率。

設(shè)定pH值為7.0、發(fā)酵溫度40℃、接種量為1%，料液比1:10，分別選取16、20、24、28h為不同的發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后計(jì)算SDF的產(chǎn)率。

設(shè)定pH值為7.0、發(fā)酵溫度40℃、發(fā)酵時(shí)間20h、料液比1:10，分別選取0.5%、0.75%、1%、1.25%為不同的接種量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后計(jì)算SDF的產(chǎn)率。

設(shè)定pH值為7.0、發(fā)酵溫度40℃、發(fā)酵時(shí)間20h、接種量1%，分別選取1:6、1:8、1:10、1:12為不同的料液比進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后計(jì)算SDF的產(chǎn)率。

1.3.2.3 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化工藝條件

通常發(fā)酵法制取DF時(shí)主要受發(fā)酵溫度、時(shí)間、接種量和料液比4個(gè)因素的交叉影響，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用DPS-9.50軟件，選擇四因素五水平的均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以SDF產(chǎn)率為考察指標(biāo)，研究4個(gè)因素對(duì)SDF產(chǎn)率的影響。選用因素和水平見表1。

表1 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and levels used in uniform design

1.3.3 DF主要成分的測(cè)定

灰分的測(cè)定：采用高溫灼燒法[9]；粗蛋白的測(cè)定：采用凱氏定氮法[10]；粗脂肪的測(cè)定：采用索氏抽提法[11]；膳食纖維：采用AOAC991.43的方法分別對(duì)SDF和TDF進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 DF理化特性的測(cè)定

1.3.4.1 膨脹力的測(cè)定[12]

準(zhǔn)確稱取膳食纖維干樣0.500g，均勻置于25mL刻度試管中后讀取干品體積V0，加入20mL蒸餾水，振蕩搖勻，于室溫條件下放置24h，觀察其自由膨脹體積V1。

1.3.4.2 持水力的測(cè)定[13]

準(zhǔn)確稱取膳食纖維干樣0.100g，移入50mL離心管中后稱質(zhì)量m0，加入蒸餾水10mL，振蕩搖勻，室溫放置1h后5000r/min離心20min，小心棄去上清液后稱質(zhì)量m1。

1.3.4.3 持油性的測(cè)定

方法同持水力的測(cè)定。選用市售植物油測(cè)定DF吸附不飽和脂肪酸的能力。

1.3.4.4 陽離子交換力的測(cè)定[14]

稱取0.500g膳食纖維干樣，加0.1mol/L的HCl 20mL，搖勻，室溫放置24h。濾紙過濾，用蒸餾水反復(fù)清洗除去多余的酸，轉(zhuǎn)移殘?jiān)饺瞧恐?，加?00mL 15g/100mL的NaCl溶液，磁力攪拌30min，以0.5%的酚酞乙醇為指示劑，0.1mol/L的氫氧化鈉溶液滴定。用蒸餾水代替HC l，記錄空白消耗的氫氧化鈉的量。

式中：V1為樣品消耗的NaOH體積/mL；V0為空白消耗的NaOH體積/mL；m為樣品干質(zhì)量/g；0.1為NaOH濃度/(mol/L)。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2007統(tǒng)計(jì)分析，重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用ANOVA進(jìn)行Turkey多重比較分析(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度對(duì)SDF產(chǎn)率的影響

圖1 不同發(fā)酵溫度對(duì)SDF產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on SDF yield

由圖1可知，發(fā)酵溫度對(duì)葡萄皮渣DF中SDF得率的影響較為顯著，在整個(gè)發(fā)酵過程中SDF產(chǎn)率表現(xiàn)為先增加后減小的趨勢(shì)，40℃時(shí)產(chǎn)率達(dá)最高值(15.15±0.78)%。由于溫度是影響微生物生長(zhǎng)的重要因素之一，微生物體內(nèi)的眾多生化反應(yīng)均需要在一定溫度下才能正常進(jìn)行，而保加利亞乳桿菌的最適發(fā)酵溫度為37℃，嗜熱鏈球菌的適宜培養(yǎng)溫度為42℃[15-16]，因此選擇40℃為最適發(fā)酵溫度。

2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)SDF產(chǎn)率的影響

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)SDF產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of fermentation time on SDF yield

由圖2可知，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，SDF產(chǎn)率逐漸提高，當(dāng)發(fā)酵20h后，SDF得率趨于穩(wěn)定，可能是由于發(fā)酵24h后原料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡，無法繼續(xù)供給微生物存活擴(kuò)增所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，另外發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)還會(huì)導(dǎo)致次級(jí)代謝產(chǎn)物積累并產(chǎn)生有害物質(zhì)，它們均會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利，造成SDF產(chǎn)率下降。綜合以上因素選取20h的發(fā)酵時(shí)間較為合理。

2.3 接種量對(duì)SDF產(chǎn)率的影響

圖3 不同接種量對(duì)SDF產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of inoculum size on SDF yield

由圖3可知，當(dāng)接種量在0.5%～1%的范圍內(nèi)時(shí)隨接種量增加，SDF產(chǎn)率也隨之增加，當(dāng)接種量超過1%時(shí)，SDF產(chǎn)率略有降低?？赡苁怯捎诮臃N量過少時(shí)，發(fā)酵劑不能提供足夠的活菌使葡萄皮渣完全發(fā)酵，導(dǎo)致SDF轉(zhuǎn)化量較少；而接種量過大時(shí)由于菌體數(shù)量多，消化分解可能會(huì)迅速完成，在發(fā)酵后期造成菌株?duì)I養(yǎng)不足，培養(yǎng)液黏度增加溶氧不足，或可溶性糖類被分解利用，從而導(dǎo)致SDF的產(chǎn)率又有所降低[17]，因此接種量應(yīng)選1%較為合理。

2.4 料液比對(duì)SDF產(chǎn)率的影響

圖4 不同料液比對(duì)SDF產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of solid/liquid ratio on SDF yield

由圖4可知，當(dāng)料液比為1:10時(shí)SDF產(chǎn)率可達(dá)到峰值(15.10±0.45)%，過高或過低的料液比均會(huì)影響SDF的得率。其中料液比為1:6和1:8時(shí)，SDF產(chǎn)率明顯偏低，可能是由于葡萄皮渣富含果膠類物質(zhì)，經(jīng)滅菌后培養(yǎng)基較為黏稠并出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象，若加水量較少會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵過程中氧氣傳遞受阻、散熱條件惡化，從而影響微生物的發(fā)酵使SDF產(chǎn)率較低；當(dāng)料液比為1:12時(shí)，含量也較低，且料液比過高導(dǎo)致后期醇析時(shí)乙醇消耗量較大[18]。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，可選擇1:10為最佳料液比。

2.5 發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

為增加試驗(yàn)點(diǎn)，選用均勻設(shè)計(jì)表U10，根據(jù)其使用表依次安排5個(gè)試驗(yàn)水平(1)～(5)。因均勻設(shè)計(jì)表U10為10水平表，而本試驗(yàn)中的4個(gè)因素均為五水平，因此采用擬水平法將表中各列的1、2水平取為對(duì)應(yīng)于該列因素的因素水平表中的(1)水平，即：(1)→1、2，(2)→3、4,…,(5)→9、10，均勻設(shè)計(jì)法制備葡萄皮渣膳食纖維的試驗(yàn)結(jié)果見表2。

試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)DPS軟件處理，用二次逐步回歸分析方法[19]，確定多元二次回歸方程，并對(duì)該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析結(jié)果見表3?；貧w方程為：

由二次回歸方程預(yù)測(cè)葡萄皮渣SDF產(chǎn)率的最大值及此時(shí)各因素的值，得到Xl＝40.4℃、X2＝20.9h、X3＝1.1%、X4＝1:9.5為最佳工藝參數(shù)。

表2 均勻設(shè)計(jì)法制備膳食纖維的試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Uniform design arrangement and corresponding results

表3 回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析Table 3 Significance test and variance analysis of the fitted regression model

由軟件分析可知，相關(guān)系數(shù)R＝0.99978，顯著水平P＝0.0457＜0.05，剩余標(biāo)準(zhǔn)差s＝0.00079，Durbin-Watson統(tǒng)計(jì)d＝2.07511737，接近2，說明該方程能很好地?cái)M合發(fā)酵法制備葡萄皮渣膳食纖維的過程，具有顯著性?；貧w系數(shù)及變量分析結(jié)果見表4。

表4 回歸系數(shù)及變量分析Table 4 Regression coefficients and their significance in the fitted regression model

從表4各變量偏回歸分析的顯著性檢驗(yàn)P值大小可知，對(duì)葡萄皮渣SDF產(chǎn)率影響的大小為：X1＞X12＞X4＞X2X3＞X2＞X3X4＞X1X3＞X1X4。從回歸的結(jié)果可知，因素之間存在交互作用，所以如果用單因素法很難得到一個(gè)較優(yōu)方案。為驗(yàn)證模型方程的適用性，同時(shí)考慮到操作方便性，將上述條件調(diào)整為發(fā)酵溫度40℃、時(shí)間21h、接種量1%、料液比1:10。平行進(jìn)行5組實(shí)驗(yàn)，SDF的產(chǎn)率為(17.25±0.23)%，接近預(yù)測(cè)值。說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型擬合良好，建立的回歸模型能真實(shí)的反映各因素對(duì)SDF產(chǎn)率的影響，通過此模型優(yōu)化能夠有效的提高SDF的產(chǎn)率。最終得到的SDF為白色蓬松狀，IDF色澤為暗黃色，無異味，合并后即為葡萄皮渣DF，其樣品顆粒大小均勻，無不良異味。

2.6 葡萄皮渣發(fā)酵前后基本成分及理化性質(zhì)的比較

表5 葡萄皮渣膳食纖維的主要成分及部分功能特性Table 5 Main components physico-chemical properties of native and fermented grape pomaces

由表5可知，葡萄皮渣原料的主要成分為DF，其中TDF含量達(dá)69.61%，SDF含量約8.37%，其他成分含量均較低，可見葡萄皮渣是一種良好的膳食纖維資源，具有一定的開發(fā)價(jià)值。發(fā)酵后的產(chǎn)物中TDF提高至84.40%，SDF含量達(dá)17.25%，相比葡萄皮渣原料TDF含量和SDF含量分別提高了14.79%和8.88%，而其他雜質(zhì)成分含量均有顯著降低。說明微生物的消化分解作用，消耗掉了大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使得膳食纖維的純度顯著提高。葡萄皮渣經(jīng)發(fā)酵后其DF的理化性質(zhì)也得到了一定的改善，其中膨脹力、持水力及持油力3項(xiàng)指標(biāo)分別達(dá)到了3.38mL/g、4.32g/g和1.87g/g，相比原料各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著提高，原因可能是因?yàn)榘l(fā)酵后葡萄皮渣中DF的相對(duì)含量提高所致，但陽離子交換能力無顯著變化。

3 結(jié) 論

3.1 葡萄皮渣是一種質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的膳食纖維資源，利用混合菌種發(fā)酵法制備的TDF整體色澤較均勻呈微黃色，無異味，顆粒大小均勻，因此，釀酒葡萄皮渣是一種很有開發(fā)前景的農(nóng)產(chǎn)品加工廢棄物。

3.2 通過試驗(yàn)優(yōu)化所得發(fā)酵法制取葡萄皮渣膳食纖維的最佳工藝條件為：發(fā)酵溫度40℃、時(shí)間21h、接種量1%、料液比1:10，在此條件下SDF的產(chǎn)率可達(dá)(17.25±0.23)%，且膨脹力、持水力、持油力等理化性質(zhì)較原料有顯著提高。

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Optimization of Microbial Fermentation of Grape Pomace for Dietary Fiber Preparation

LING Bo1，TIAN Yun-bo1，WU Hong-bin2，MING Jian1,3,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Instiute of Agro-food Science and Technology,Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation, Shihezi 832000, China；3. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400715, China)

Wine grape pomace was fermented with bothLactobacillus bulgaricusandStreptococcus thermophilusto prepare soluble dietary fiber (SDF). Four fermentation conditions affecting SDF yield including temperature, time, inoculum size and material-to-liquid ratio were optimized by one-factor-at-a-time and uniform design methods. The optimal fermentation conditions were determined as 40 ℃, 21 h, 1% and 1:10. Under these conditions, the SDF yield was (17.25 ± 0.23)%. The swelling capacity, water holding capacity and oil holding capacity of the prepared SDF were 3.38 mL/g, 4.32 g/g and 1.87 g/g respectively.Compared with the raw material, the purity and physico-chemical properties of the SDF were improved. In conclusion,microbial fermentation is a good method to prepare high-quality SDF.

grape pomace；dietary fiber；fermentation

R972.6

A

1002-6630(2012)15-0178-05

2011-09-05

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA100805-2)；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)工業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目(2009GG39)；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)博士資金項(xiàng)目(2009JC12)

令博(1986 —)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：6lb6lb@163.com

*通信作者：明建(1972 —)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：mingjian1972@163.com