張新富，朱 翔，劉亞軍，夏 濤*，杜先鋒，高麗萍，張德龍

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)教育部、農(nóng)業(yè)部重點實驗室，安徽 合肥 230036；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，山東 青島 266109；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230036；4.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 微生物防治安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230036)

油茶皂素大孔樹脂純化工藝優(yōu)化及LC/TOF-MS分析

張新富1,2，朱 翔3，劉亞軍3，夏 濤1,*，杜先鋒1，高麗萍3，張德龍4

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)教育部、農(nóng)業(yè)部重點實驗室，安徽 合肥 230036；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，山東 青島 266109；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230036；4.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 微生物防治安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230036)

以市售低純度茶皂素粗品為原料，采用AB-8大孔樹脂進行純化，得到最佳純化工藝為30g/L粗皂素溶液上樣，30%乙醇洗脫除去多數(shù)色素和部分蛋白等雜質(zhì)，70%乙醇溶液主要洗脫出茶皂素，油茶皂素的得率為55.5%，純度提高1.86倍。大孔樹脂重復(fù)利用8次后，吸附和洗脫效果基本不變，放大試驗證明其適合工業(yè)化生產(chǎn)。LC/TOF-MS分析表明油茶皂素的分子質(zhì)量主要集中在1170～1304D之間，并確定了一種油茶皂素的分子式為C58H89O26，同時推測了其結(jié)構(gòu)式。

茶皂素；大孔樹脂；LC/TOF-MS

茶皂素是山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)植物皂素的統(tǒng)稱，是一類結(jié)構(gòu)相近的齊墩果烷型五環(huán)三萜類皂甙的混合物，其基本結(jié)構(gòu)由皂甙元、糖體、有機酸三部分組成，又稱作茶皂甙、茶皂苷[1-3]。茶皂素是一種純天然的非離子型表面活性劑，具有溶血、抗?jié)B消炎、抗菌等生物活性，廣泛應(yīng)用于日用化工業(yè)、建筑業(yè)、紡織業(yè)、食品業(yè)以及醫(yī)藥行業(yè)等[4]。

1931年，日本學(xué)者青山新次郎首次從茶葉中分離得到茶皂素，隨后幾十年，Masayuki等從茶樹(Camellia sinensis)的根、葉、花和種子中分離純化出56種茶皂苷單體，并對茶皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)進行了深入的研究[5]。近幾年來，逐漸出現(xiàn)了從油茶(Camellia oleifera)和茶梅(Camellia sasanqua)中分離茶皂素的報道，Huang等[6]從油茶(Camellia oleifera)餅粕分離純化出一種叫做sasanquasaponin的茶皂苷物質(zhì)，并研究了它對癌細胞的作用；Chaicharoenpong等[7]從油茶(Camellia oleifera)餅粕中分離了camelliasaponin 1、theasaponin E1、theasaponin E2，并研究了它們的定量分析方法；Kuo 等[8]從油茶(Camellia oleifera)籽中分離了一個茶皂素混合物(camelliasaponin)，并研究了它的殺蟲效果；Matsuda等[9]從茶梅(Camellia sasanqua)的花中分離了5個新的皂苷sasanquasaponin Ⅰ～Ⅴ，并研究了它們的生物活性。油茶餅中含有11%～13%的油茶皂素(sasanquasaponin，SQS)，含量非常高，工業(yè)上常用有機溶劑進行油茶皂素的提取[10]，其純化方法主要有沉淀法、萃取法、大孔樹脂層析法、膜法等[11]，但其純度較低，含有較多量的蛋白質(zhì)、色素、糖類等雜質(zhì)，因此需要進一步純化；油茶中的皂苷類成分也非常多，有待于進一步研究。本研究優(yōu)化大孔樹脂純化油茶皂素的工藝，為工業(yè)化開發(fā)提供依據(jù)；并對油茶皂素進行LC/TOFMS分析，為油茶皂素單體的進一步研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶皂素粗品(通常稱為茶皂素，純度41%) 杭州中野天然植物有限公司；大孔樹脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司；乙腈、甲醇、乙酸均為色譜純；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

飛行時間質(zhì)譜儀(TOF) 美國Agilent公司；液相分析色譜儀 日本島津公司；紫外-可見分光光度計；恒溫水浴鍋；熱風(fēng)干燥箱；電子天平；移液槍。

1.3 分析測定方法

樹脂含水量測定：105℃烘至質(zhì)量恒定[12]；油茶總皂甙的測定：香草醛-硫酸顯色法[13-14]；蛋白質(zhì)的測定：考馬斯亮藍比色法[15]；色素的測定：在波長420nm處測定吸光度[16-17]。

LC/TOF-MS分析：Aglilent Zorbax Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，檢測波長為280nm，柱溫箱設(shè)定為25℃，流速1.0mL/min，A相為0.2%乙酸，B相為100%乙腈，0～15min內(nèi)流動相B由35%升至40%，45min時升到60%，55min時再升到80%，60min時回至35%；飛行時間質(zhì)譜儀(time of flight mass spectromter，TOF)檢測：電噴霧離子源(ESI)，霧化氣壓30psi，氮氣流速12L/min，陰離子模式檢測，離子化電壓為3500V，碎片電壓175V。

1.4 方法[12,16,18]

1.4.1 不同樹脂的靜態(tài)吸附洗脫實驗

吸附量的測定：將1g(干質(zhì)量)大孔樹脂預(yù)處理后，置于帶塞三角瓶中，加入30mL 10g/L的茶皂素溶液，25℃搖12h，瀝出溶液，定容至50mL，按照1.3節(jié)方法進行茶皂素、蛋白、色素的測定。

洗脫量的測定：將吸附飽和的樹脂用20mL去離子水沖洗4次，然后加入30mL的80%乙醇溶液洗脫，25℃搖12h，洗脫液定容至50mL，按照1.3節(jié)方法進行茶皂素、蛋白、色素的測定。

1.4.2 AB-8樹脂吸附濃度與吸附效果實驗

稱取AB-8樹脂1g(干質(zhì)量)共7份，預(yù)處理后分別加入30mL質(zhì)量濃度為2.5、5、10、20、30、40、50g/L的粗皂素溶液，25℃搖12h，過濾，用20mL去離子水沖洗樹脂4次，定容至50mL，然后加入80%乙醇溶液30mL，25℃搖12h，洗脫后定容至50mL，測定茶皂素含量。

1.4.3 吸附動力學(xué)實驗

稱取1g(干質(zhì)量)AB-8樹脂，預(yù)處理后裝入帶塞三角瓶中，加入30mL 30g/L的粗茶皂素溶液，每10min取0.1mL測定茶皂素含量。

1.4.4 AB-8樹脂動態(tài)洗脫條件的優(yōu)化

稱取4g(干質(zhì)量)AB-8大孔樹脂，預(yù)處理后裝入玻璃柱中(460mm×10mm i.d.)，用95%乙醇溶液沖柱，再用去離子水沖至無醇味。30g/L粗皂素溶液上樣120mL后，用100mL去離子水沖洗殘留上樣液后，分別用20、30、40、50、60、70、80、90、100%乙醇溶液100mL進行洗脫，分別測定計算茶皂素、蛋白質(zhì)和色素的洗脫率，選擇出最佳洗脫條件。

1.4.5 大孔樹脂重復(fù)使用性能考察

稱取4g(干質(zhì)量)AB-8大孔樹脂，預(yù)處理后，30g/L粗皂素水溶液上樣60mL后，用100mL去離子水沖洗殘留上樣液后，分別用30%、70%和95%乙醇溶液各100mL洗脫，連續(xù)使用8個周期，考察大孔樹脂的吸附洗脫能力。

1.4.6 AB-8樹脂放大實驗

在已經(jīng)確定的洗脫條件下，按比例放大并考察洗脫效果：稱取270g(干質(zhì)量)AB-8樹脂，預(yù)處理后裝柱(5cm×130cm i.d)，30g/L茶皂素溶液上樣5L，分別用30%、70%乙醇溶液梯度洗脫，洗脫液各6L。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同大孔樹脂的特性

表1 不同大孔樹脂的物理特性Table 1 Physical characteristics of different macroporous resins used in this study

已有的研究發(fā)現(xiàn)離子交換樹脂對皂苷具有較強的吸附能力，但洗脫率偏低[19]，極性大孔樹脂對皂苷的吸附率和洗脫率均偏低[12]，所以本實驗選擇不同比表面積和孔徑的中極性、弱極性和非極性大孔樹脂進行研究，其對油茶皂素的吸附與洗脫效果如圖1所示。

圖1 不同大孔樹脂對茶皂素的吸附洗脫效果Fig.1 Elution capacities of sasanquasaponin from different macroporous resins

由圖1可以看出，AB-8樹脂相對于其他幾種型號的樹脂對茶皂素具有較高的吸附率和洗脫率，均達到85%以上，這可能與AB-8樹脂具有較大的孔徑(表1)有關(guān)系，故選擇AB-8樹脂進行后繼實驗。

2.2 AB-8樹脂的吸附等溫線

圖2 AB-8樹脂的吸附等溫線Fig.2 Absorption isotherm for SQS on AB-8 resin

由圖2可以看出，當茶皂素粗品溶液濃度較低時，AB-8樹脂的吸附容量隨其質(zhì)量濃度的增加呈直線上升，進一步說明AB-8樹脂對油茶皂素具有較好的吸附效果。當質(zhì)量濃度30g/L時，AB-8樹脂的吸附容量基本達到飽和狀態(tài)，其吸附容量隨質(zhì)量濃度的增加變化不明顯，因此選擇30g/L的皂素質(zhì)量濃度用來做后繼實驗。

2.3 AB-8樹脂的吸附動力學(xué)特性

圖3 AB-8樹脂對茶皂素的吸附動力學(xué)Fig.3 Adsorption kinetics of AB-8 macroporous resin for sasanquasaponin

由圖3可以看出，隨著吸附時間的延長，AB-8大孔樹脂的吸附容量在增加，前30min吸附容量增加迅速，呈直線上升，這也說明AB-8樹脂對油茶皂素具有很好的吸附效果。隨著吸附時間的進一步延長，其吸附容量繼續(xù)增加，但增加幅度變緩，當吸附時間達到70min時，吸附容量基本達平衡狀態(tài)，考慮到實際應(yīng)用中效率及生產(chǎn)成本問題，結(jié)合其吸附效果，吸附時間不應(yīng)少于30min，所以本實驗條件下，上樣速度不能超過1mL/min。

2.4 AB-8樹脂的洗脫條件的優(yōu)化

圖4 不同體積分數(shù)乙醇溶液對茶皂素、蛋白質(zhì)、色素洗脫率的影響Fig.4 Effect of different concentrations of ethanol solution on the elution of sasanquasaponin, pigments and proteins

由圖4可以看出，體積分數(shù)為2 0%、3 0%乙醇溶液能夠洗脫26.2%的茶皂素，而色素被洗脫掉64.5%，蛋白質(zhì)被洗脫掉8.7%，說明30%乙醇溶液洗脫AB-8樹脂，對茶皂素中色素的脫除具有很好的效果，同時又脫除掉部分蛋白；質(zhì)量分數(shù)為70%乙醇溶液能夠洗脫出絕大部分茶皂素，色素和蛋白質(zhì)同時被洗脫出一小部分，說明其純化效果較好。因此為了簡化工藝，選擇30%乙醇溶液洗脫除去絕大多數(shù)色素和部分蛋白后，直接用70%乙醇溶液洗脫得到純化后的茶皂素，此工藝簡單易行，節(jié)約乙醇，適合進一步擴大生產(chǎn)。經(jīng)計算，70%乙醇溶液洗脫液茶皂素純度提高1.86倍，得率為55.5%。

2.5 AB-8樹脂的性能考察

圖5 AB-8樹脂的性能考察Fig.5 Repeated usability of AB-8 macroporous resin for sasanquasaponin purification

從圖5可以看出，AB-8樹脂前8次連續(xù)上樣，其吸附率均維持在85%左右，洗脫率(70%乙醇溶液洗脫部分)在45%以上，降低不明顯。由此可見，AB-8樹脂在純化油茶皂素時可以重復(fù)利用多次，均能保持較高的吸附率和洗脫率，其再生也比較方便易行，價格也較便宜，因此可用于工業(yè)化開發(fā)。

2.6 放大試驗

按照1.4.6節(jié)方法進行放大試驗，70%乙醇溶液洗脫得到純化后的油茶皂素，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇后噴霧干燥后稱量為78.91g，得率為52.6%，純度提高1.82倍，達到了預(yù)期的效果。

2.7 LC/TOF-MS分析

把放大實驗中后70%乙醇洗脫部分進一步純化進行LC/TOF-MS分析，結(jié)果見圖6、表2。

表2 油茶皂素分子質(zhì)量Table 2 MS data of purified sasanquasaponin

從圖6可看出，油茶皂素由多種化合物組成，4～10、13～15號峰在紫外下吸收不強，但離子峰很強，其余峰紫外吸收與離子吸收趨勢基本一致，這可能是由于皂甙元上所連的有機酸具有不同的雙鍵所致，使某些皂素雖然含量很低，但紫外吸收卻很強。從表2可以看出，油茶皂素的分子質(zhì)量主要集中在1170～1304D之間，這與有關(guān)文獻報道的茶皂素的分子質(zhì)量范圍相一致[20-23]，但這些茶皂素均是從茶樹(Camellia sinensis)的葉片和種子中發(fā)現(xiàn)的，油茶(Camellia oleifera)中的皂素結(jié)構(gòu)報道較少[5]，表2中所列主要油茶皂素的分子質(zhì)量與報道的茶樹中的皂素的分子質(zhì)量范圍基本一致，但其結(jié)構(gòu)式有待于進一步研究。

LC-MS/MS分析得出，11號峰的m/z為1201([MH]-)，二級MS碎片m/z主要有1021、889、665，如圖7(A)所示，這可能是由于茶皂素分子丟失一個己糖m/z變?yōu)?021([M－H－C6H11O6]-)，再丟失一個戊糖m/z變?yōu)?89([M－H－C11H19O10]-)，m/z665處的離子峰是三萜類化合物分子的主要片段，推測該化合物分子式為C58H89O26，通過LC-MS/MS分析數(shù)據(jù)和對比參考文獻[8,23]，預(yù)測結(jié)構(gòu)式如圖7(B)所示。

圖7 油茶皂素二級MS分裂圖Fig.7 MS/MS fragmentation of peak 11(shown in Fig.6)

3 結(jié) 論

3.1 大孔樹脂能夠顯著提高油茶皂素的純度并適合工業(yè)化開發(fā)，其最佳工藝為30g/L粗皂素溶液上樣、30%乙醇溶液洗脫除去雜質(zhì)、70%乙醇洗脫茶皂素，得率為55.5%，純度提高1.86倍。大孔樹脂可重復(fù)利用多次(8次)，放大試驗?zāi)軌虮３诸A(yù)期的純化效果，證明其適合工業(yè)化生產(chǎn)。

3.2 LC/TOF-MS分析表明油茶(Camellia oleifera)中皂素的分子質(zhì)量主要集中在1170～1304D之間，與茶樹(Camellia sinensis)中的皂素分子質(zhì)量范圍基本一致，并確定了一種油茶皂素的分子式為C58H89O26，同時推測了其結(jié)構(gòu)式。

[1] 宛曉春. 茶葉生物化學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2003: 58-62.

[2] 胡婕倫, 聶少平, 龔毅, 等. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化茶皂素提取工藝的研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(18): 106-109.

[3] YOSHIKAWA M, MORIKAWA T, LI Ning, et al. Bioactive saponins and glycosides.. triterpene saponins with gastroprotective effect from the seeds ofCamellia sinensis- theasaponins E3, E4, E5, E6, and E7[J].Chem Pharm Bull, 2005, 53(12): 1559-1564.

[4] 陳力, 鄧澤元, 胡蔣寧, 等. 高速逆流色譜分離制備茶粕中茶皂素單體[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(20): 127-131.

[5] 費學(xué)謙. 高速逆流色譜純化茶皂素的方法: 中國, 102093461A[P].2011-06-15.

[6] HUANG Qiren, HE Ming, CHEN Heping, et al. Protective effects of sasanquasaponin on injury of endothelial cells induced by anoxia and reoxygenationin vitro[J]. Basic & Clinical Pharmacology Toxicology,2007, 101(5): 301-308.

[7] CHAICHAROENPONG C, PETSOM A. Quantitative thin layer chromatographic analysis of the saponins in tea seed meal[J]. Phytochemical Analysis, 2009, 20(3): 253-255.

[8] KUO P C, LIN T C, YANG C W. Bioactive saponin from tea seed pomace with inhibitory effects againstRhizoctonia solani[J]. J Agric Food Chem, 2010, 58(15): 8618-8622.

[9] MATSUDA H, NAKAMURA S, FUJIMOTO K, et al. Medicinal flowers.ⅩⅩⅩⅠ . acylated oleanane-type triterpene saponins, Sasanquasaponins I-Ⅴ, with antiallergic activity from the flower buds ofCamellia sasanqua[J]. Chem Pharm Bull, 2010, 58(12): 1617-1621.

[10] 王武, 方紅美, 劉京生, 等. 茶葉籽餅粕中茶皂素提取工藝研究[J].食品科學(xué), 2008, 29(9): 230-233.

[11] 袁新越, 江河源, 張建勇. 茶皂素的提取制備技術(shù)[J]. 中國茶業(yè), 2009(4): 8-10.

[12] WAN J B, ZHANG Q W, YE W C, et al. Quantification and separation of protopanaxatriol and protopanaxadiol type saponins fromPanax notoginsengwith macroporous resins[J]. Separation and Purification Technology, 2008, 60(2): 198-205.

[13] 侯如燕, 宛曉春, 黃繼軫. 油茶皂苷標準品的制備及定量方法的比較[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2005, 31(8): 62-65.

[14] 屈姝存, 唐明遠. 油茶皂角苷的純化與含量測定[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1999, 25(3): 257-259.

[15] 李建武. 生物化學(xué)實驗原理和方法[M]. 北京: 北京大學(xué)出版社, 2001.

[16] LIU Jun, LUO Jianguang, SUN Yi, et al. A simple method for the simultaneous decoloration and deproteinization of crude levan extract fromPaenibacillus PolymyxaEJS-3 by macroporous resin[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(15): 6077-6083.

[17] 涂云飛, 楊秀芳, 孔俊豪. 堿性水飽和正丁醇萃取體系聯(lián)合大孔樹脂純化茶皂素研究[J]. 茶葉科學(xué), 2010, 30(增刊1): 556-560.

[18] NIE W, LUO J G, WANG X B, et al. An insight into enrichment and separationⅩ of oleanane-type triterpenoid saponins by various chromatographic materials[J]. Separation and Purification Technology, 2009,65(3): 243-247.

[19] 侯如燕, 宛曉春, 黃繼軫. 采用大孔樹脂法純化油茶皂苷的工藝條件[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2005, 31(2): 130-132.

[20] WU Qingbin, WANG Yan, GUO Meili. Triterpenoid saponins from the seeds ofCelosia argenteaand their anti-inflammatory and antitumor activities[J]. Chem Pharm Bull, 2011, 59(5): 666-671.

[21] JIAN Honglei, LIAO Xiaoxia, ZHU Liwei, et al. Synergism and foaming properties in binary mixtures of a biosurfactant derived fromCamellia oleiferaAbel and synthetic surfactants[J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2011, 359(2): 487-492.

[22] MATSUI Y, KOBAYASHI K, MASUDA H, et al. Quantitative analysis of saponins in a tea-leaf extract and their antihypercholesterolemic activity[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2009, 73(7): 1513-1519.

[23] YOSHIKAWA M, MORIKAWA T, NAKAMURA S, et al. Bioactive saponins and glycosides.. acylated oleanane-type triterpene saponins from the seeds of tea plant (Camellia sinensis)[J]. Chem Pharm Bull,2007, 55(1): 57-63.

Purification by Macroporous Adsorption Resin Chromatography and LC/TOF-MS Analysis of Sasanquasaponin

ZHANG Xin-fu1,2，ZHU Xiang3，LIU Ya-jun3，XIA Tao1,*，DU Xian-feng1，GAO Li-ping3，ZHANG De-long4
(1. Key Laboratory of Tea Biochemistry and Biotechnology, Ministry of Education and Ministry of Agriculture, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；2. College of Landscape and Horticulture, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China；3. School of Biology Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；4. Anhui Provincial Key Laboratory of Microbial Pest Control, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)

AB-8 macroporous resin was used to purify commercial crude sasanquasaponin with low purity. The optimal purification process was determined as follows: 30 g/L crude sample solution was loaded followed by washing the resin with 30% ethanol aqueous solution to remove unwanted impurities including most pigments and partial proteins, and the adsorbed sasanquasaponin was finally eluted with 70% ethanol aqueous solution, resulting in a recovery of 55.5% and a purification factor of 1.86. After eighth repeated use, the adsorption and elution capacities of this resin were unchanged basically. Furthermore, the scale-up experiments demonstrated the suitability for industrial production. The LC-TOF-MS analysis indicated that the molecular weight of the purified sasanquasaponin mainly varied between 1170 and 1304 D. In addition, a sasanquasaponin compound with molecular formula C58H89O26 was identified and its structural formula was deduced.

sasanquasaponin；macroporous resin；LC/TOF-MS

R284.2

A

1002-6630(2012)16-0007-05

2011-06-29

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2009BADB1B10)

張新富(1979—)，男，講師，博士研究生，研究方向為制茶工程與天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：zxftea@163.com

*通信作者：夏濤(1962—)，男，教授，博士，研究方向為制茶工程與天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：xiatao62@126.com