于陽(yáng)陽(yáng)，包怡紅*

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

堿溶性東北山核桃蛋白的提取及SDS-PAGE分析

于陽(yáng)陽(yáng)，包怡紅*

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

以經(jīng)超臨界CO2去除油脂后的東北山核桃仁渣為原料，利用堿提法對(duì)山核桃渣進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，考察NaOH溶液濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)蛋白提取率的影響，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定堿溶性山核桃仁蛋白最佳提取條件和其等電點(diǎn)。同時(shí)對(duì)堿溶性山核桃蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析。結(jié)果表明：當(dāng)提取液NaOH濃度0.02mol/L、料液比1:30(g/mL)、提取溫度50℃、提取時(shí)間1.5h時(shí)，堿溶性山核桃蛋白提取率最大可達(dá)88.05%，其等電點(diǎn)為4.5。SDS-PAGE分析結(jié)果表明，堿溶性山核桃蛋白分子質(zhì)量主要分布在100、60、36kD和20kD 四個(gè)區(qū)域。

山核桃；堿溶性蛋白；提取；SDS-PAGE；分子質(zhì)量

東北山核桃即核桃楸(Juglans mandshurica)屬于胡桃科胡桃屬，又名胡桃楸、楸子或山核桃。主要分布于我國(guó)黑龍江大、小興安嶺，吉林，遼寧，內(nèi)蒙古東部，河北，山西，河南等地[1]。

東北山核桃果仁中含有豐富的蛋白質(zhì)、8種人體必需氨基酸酸、礦質(zhì)元素、多種不飽和脂肪酸和維生素，而碳水化合物的含量較低[2]。東北山核桃屬純天然野生堅(jiān)果類(lèi)，與核桃相似，具有潤(rùn)肺、強(qiáng)腎、降低血脂、預(yù)防冠心病的功能，長(zhǎng)期食用能夠益壽養(yǎng)顏、抗衰老，孕婦食用對(duì)胎兒智力發(fā)育有很好的幫助[3-6]。

目前以東北山核桃為原料的研究，主要集中在其種仁中油脂的提取和功能方面。蘇玖玲等[7]研究了以山核桃為原料，利用有機(jī)溶劑法、超臨界CO2提取法和酶法提取油脂，得到最佳工藝條件，并對(duì)核桃油的穩(wěn)定性和降血脂功能進(jìn)行了初步分析。而以脫脂后的山核桃渣為原料，研究其蛋白質(zhì)提取的報(bào)道還較少見(jiàn)。SDS電泳是測(cè)定蛋白質(zhì)亞基分子質(zhì)量的一種簡(jiǎn)單、快速、可靠的方法，如大豆蛋白、白果蛋白、苦蕎麥蛋白等蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量已經(jīng)通過(guò)該方法測(cè)定[8-10]。

本實(shí)驗(yàn)以粉碎后經(jīng)超臨界CO2去除油脂的東北山核桃仁(即核桃渣)為原料，提取其堿溶性蛋白質(zhì)，通過(guò)正交試驗(yàn)確定最佳提取條件，同時(shí)確定堿溶性山核桃蛋白的等電點(diǎn)。并利用SDS電泳檢測(cè)出堿溶性山核桃仁蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分布。旨在為今后東北山核桃蛋白質(zhì)的進(jìn)一步科學(xué)研究和綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

經(jīng)過(guò)超臨界CO2脫脂的東北山核桃仁渣山核桃渣。SDS-PAGE電泳所用試劑、蛋白質(zhì)電泳Marker等。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；電泳自動(dòng)成像儀美國(guó)BIO-RAD生化科技有限公司；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PB-10標(biāo)準(zhǔn)型酸度計(jì) 上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；凱氏定氮裝置。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將篩選好的山核桃仁粉碎后，經(jīng)超臨界CO2萃取核桃油，操作條件為壓力35MPa、分離溫度40℃、時(shí)間4h[7]。脫脂后的山核桃渣過(guò)40目篩后備用，其中蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用微量凱氏定氮法[11]。

1.3.2 堿溶性山核桃蛋白提取率測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000g的脫脂山核桃渣→NaOH溶液提取→4000r/min，離心10min→上清液稀釋一定倍數(shù)后，采用福林-酚比色法[12]測(cè)定上清液蛋白含量。

1.3.3 堿溶性山核桃蛋白等電點(diǎn)測(cè)定

原料經(jīng)堿溶液提取后，4000r/min，離心10min取上清蛋白液，加入0.1mol/L HCl溶液調(diào)pH值分別為2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8，混合均勻，靜置30min，4000r/min，離心10min，去上清液后，稱(chēng)量下層沉淀質(zhì)量，沉淀量最多的即為堿溶性山核桃蛋白的等電點(diǎn)[13]。

1.3.4 堿溶性山核桃蛋白提取的單因素試驗(yàn)

以NaOH溶液為提取液，在固定提取工藝條件：提取溫度45℃、提取時(shí)間2h、料液比1:30(g/mL)、NaOH溶液濃度0.01mol/L情況下，分別考察NaOH溶液濃度0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1mol/L，料液比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60，提取溫度35、40、45、50、55、60℃，提取時(shí)間1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h對(duì)山核桃蛋白提取率的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以NaOH溶液濃度、料液比、溫度、時(shí)間為考察因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 堿溶性山核桃蛋白的提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels tested in orthogonal array design

1.3.6 SDS-PAGE凝膠電泳試驗(yàn)

采用電泳儀進(jìn)行不連續(xù)雙垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳[14]。將山核桃蛋白提取液與樣品緩沖液(pH6.8、1mol/L Tris-HCl緩沖液1.6mL、甘油2.0mL、10% SDS 4.0mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%溴酚藍(lán)0.5mL、β-巰基乙醇1.0mL、去離子水定容至20mL)按1:1的體積比例混合，100℃煮沸5min，10000r/min，離心10min，上樣20μL，分離膠質(zhì)量濃度12mg/100mL，濃縮膠質(zhì)量濃度5mg/100mL。開(kāi)始電壓80V，進(jìn)入分離膠后110V，電泳時(shí)間2.5～3.5h?？捡R斯亮藍(lán)R-250熱染20min，放入脫色液中搖床脫色，直至膠片背景藍(lán)色完全透明狀，電泳自動(dòng)成像儀拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品蛋白質(zhì)含量

東北山核桃仁粉碎后經(jīng)超臨界CO2在壓力35MPa、分離溫度4 0℃、時(shí)間4 h的條件下脫脂后得試驗(yàn)樣品，樣品山核桃渣經(jīng)凱氏定氮測(cè)得其粗蛋白質(zhì)含量為55.032%。

2.2 堿溶性山核桃蛋白等電點(diǎn)測(cè)定

圖1 堿溶性山核桃蛋白質(zhì)等電點(diǎn)Fig.1 Isoelectric point of alkali-soluble pecan proteins extracted from Juglans mandshurica Maxim kernel

由圖1可知，當(dāng)pH值由2逐漸升高時(shí)，沉淀蛋白含量逐漸增加，pH4.5時(shí)，蛋白沉淀量最多為12.29mg。p H值繼續(xù)升高超過(guò)5.5時(shí)，蛋白沉淀量減少。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)附近時(shí)，其溶解性較低，易沉淀，根據(jù)圖示結(jié)果，確定堿溶性山核桃蛋白的等電點(diǎn)為4.5。

2.2 堿溶性山核桃蛋白提取單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取液濃度對(duì)山核桃蛋白提取率的影響

圖2 NaOH溶液濃度對(duì)山核桃蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of NaOH concentration on the extraction yield of alkalisoluble proteins

由圖2可知，隨著堿液濃度逐漸增加蛋白質(zhì)提取率也隨之增加，堿液濃度增加至0.01mol/L時(shí)，蛋白質(zhì)提取率增加較明顯，當(dāng)堿液濃度0.05mol/L時(shí)提取率達(dá)到最大為85.379%，堿液濃度繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)提取率有下降趨勢(shì)。堿液濃度增加在一定范圍內(nèi)可提高堿溶性蛋白的提取率，但濃度過(guò)高，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而變性，使其提取率下降。同時(shí)，堿液濃度過(guò)大，使蛋白提取液堿性過(guò)強(qiáng)，限制了其利用范圍。綜合考慮，確定提取所用NaOH溶液的濃度為0.01mol/L。

2.2.2 料液比對(duì)山核桃蛋白提取率的影響

圖3 料液比對(duì)山核桃蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of material-to-solvent ratio on the extraction yield of alkali-soluble proteins

由圖3可知，隨著提取劑用量的增加，蛋白質(zhì)提取率增加，當(dāng)料液比為1:30時(shí)，蛋白質(zhì)提取率達(dá)80.087%，提取劑用量繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)提取率增加不明顯。考慮到實(shí)際操作方便和成本問(wèn)題，確定1:30為最佳料液比。

2.2.3 提取溫度對(duì)山核桃蛋白提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)提取溫度從35℃升高到45℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率也隨之增加，溫度45℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率最高為82.325%。但溫度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)提取率隨之下降，其原因是，高溫可導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，溶解性降低。

圖4 提取溫度對(duì)山核桃蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction yield of alkali-soluble proteins

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)山核桃蛋白提取率的影響

圖5 提取時(shí)間對(duì)山核桃蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extraction yield of alkali-soluble proteins

由圖5可知，隨提取時(shí)間延長(zhǎng)，原料蛋白質(zhì)提取率增加，1.5h達(dá)到最大為83.034%，提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，可能由于作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，使其提取率下降。所以，確定最佳提取時(shí)間為1.5h。

2.3 山核桃蛋白質(zhì)提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

表2 山核桃蛋白質(zhì)提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and corresponding results

由表2可知，影響山核桃蛋白提取率的因素主次順序?yàn)锳(NaOH溶液濃度)＞B(料液比)＞D(提取時(shí)間)＞C(提取溫度)。最佳提取山核桃蛋白的工藝為A3B2C3D2，即在NaOH溶液濃度0.02mol/L、料液比1:30、提取溫度50℃、提取時(shí)間1.5h條件下，山核桃蛋白的提取率最大。在最佳提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，山核桃蛋白質(zhì)平均實(shí)際提取率為88.05%。

2.4 SDS-PAGE凝膠電泳試驗(yàn)結(jié)果

圖6 堿溶性山核桃蛋白的SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE of alkali-soluble pecan proteins extracted from Juglans mandshurica Maxim kernel

由圖6可知，電泳結(jié)果條帶清晰，可以看出來(lái)堿溶性山核桃蛋白分子質(zhì)量較低，主要為100、60、36、20kD。Labuckas等[15]對(duì)核桃蛋白的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：利用0.1mol/L Na2B4O7提取的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量條帶清晰可見(jiàn)，而利用0.1mol/L NaOH溶液提取的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量基本在100kD以下，但是電泳條帶彌散不清，不能確定具體分子質(zhì)量大小?？梢?jiàn)不同提取液及提取液濃度均可導(dǎo)致得到的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的不同。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以經(jīng)超臨界CO2去除油脂后的東北山核桃渣為原料，利用堿提法對(duì)山核桃渣進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取，根據(jù)單因素和正交試驗(yàn)結(jié)果可知，影響山核桃蛋白提取率的因素主次順序?yàn)锳(NaOH溶液濃度)＞B(料液比)＞D(提取時(shí)間)＞C(提取溫度)。堿溶性山核桃仁蛋白最佳提取條件為NaOH溶液濃度0.02mol/L、料液比1:30、提取溫度50℃、提取時(shí)間1.5h，此條件下堿溶性山核桃蛋白提取率最大為88.05%。通過(guò)試驗(yàn)確定堿溶性山核桃蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為4.5。對(duì)堿溶性山核桃蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，其分子質(zhì)量主要分布在100、60、36kD和20kD 四個(gè)區(qū)域。

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Extraction and SDS-PAGE Analysis of Alkali-Soluble Proteins fromJuglans mandshuricaMaxim Kernels

YU Yang-yang，BAO Yi-hong*
(School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

The extraction of alkali-soluble proteins fromJuglans mandshuricaMaxim kernel waste left over after oil extraction with supercritical carbon dioxide was optimized using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. The effects of NaOH concentration, material-to-solvent ratio, temperature and extraction time on the extraction yield of protein. It was found that the highest extraction yield of protein, 88.05%, was obtained after 1.5 h of extraction with 0.02 mol/L NaOH solution at a material-to-solvent ratio of 1:30 and 50 ℃. The isoelectric point of the extract obtained under these conditions was measured to be 4.5. SDS-PAGE analysis showed that the molecular weight distribution of alkali-soluble proteins fromJuglans mandshuricaMaxim kernels was mainly 100, 60, 36 kD and 20 kD.

Juglans mandshuricaMaxim；alkali-soluble protein；extraction；SDS-PAGE；molecular weight

TS201.1

A

1002-6630(2012)18-0010-04

2011-07-09

中央高?；痦?xiàng)目(LD09C14)

于陽(yáng)陽(yáng)(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苄允称芳爸参镔Y源深加工與利用。

E-mail：yuyangyang.1986@163.com

*通信作者：包怡紅(1970—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化、功能性食品。E-mail：baoyihong@163.com