孫清瑞，張東杰*，劉志明，鹿保鑫，王 琴，張清榮

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

有機相酶法制備溶血磷脂工藝

孫清瑞，張東杰*，劉志明，鹿保鑫，王 琴，張清榮

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

以大豆?jié)饪s磷脂為原料，通過響應(yīng)面分析法研究有機相酶法制備溶血磷脂的工藝條件，得出溶血磷脂酸值與影響因素間的回歸模型，根據(jù)模型進行工藝參數(shù)優(yōu)化。同時，用紅外光譜法和高效液相色譜法對所得磷脂進行分析。結(jié)果表明，在正己烷有機相中利用磷脂酶A1制備溶血磷脂的最佳工藝參數(shù)：反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時間13h、加酶量4%、加水量17%、磷脂質(zhì)量濃度24g/100mL，該條件下磷脂酸值為73.8mg KOH/g。該脫油溶血磷脂中磷脂酰膽堿和1-?；?溶血磷脂酰膽堿含量分別為6.79%和4.45%。

溶血磷脂；磷脂；磷脂酶A1；響應(yīng)面分析法

大豆磷脂除具有生理活性外，還具有乳化、增溶、潤濕等性能，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[1]。溶血磷脂是僅含有一個脂肪?；牧字琜2-8]，引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，溶血磷脂保留了普通磷脂的雙親兩性結(jié)構(gòu)，更在一定程度上改變了由于親水親油平衡值(hydrophil and lipophile balance，HLB)偏低而致普通磷脂應(yīng)用范圍受限制的狀況[9]。同時溶血磷脂的一些特殊性能亦引起生理藥理學(xué)家的極大興趣，因此極具開發(fā)價值[10-12]。在有機相中進行酶促反應(yīng)具有以下優(yōu)點[13]：1)微生物不易存活；2)反應(yīng)物不易變質(zhì)；3)可以更好的保持酶活；4)有機溶劑的沸點較低，方便脫溶。磷脂酶A1(lectiase ultra)是一種羧酸酯水解酶，經(jīng)基因改造的米曲霉深層發(fā)酵而得的，其基因供體為尖孢鐮刀霉和棉狀嗜熱絲孢菌，因此具有酶源廣的優(yōu)點。它能催化磷脂水解生成2-酰基-溶血磷脂和脂肪酸，但2-?；?溶血磷脂會部分發(fā)生?；灰粕?-?；?溶血磷脂。

在有機相中利用磷脂酶A1催化大豆?jié)饪s磷脂水解制備溶血磷脂，國內(nèi)尚未見文獻報道。本實驗進行磷脂酸值比較以探討適宜的反應(yīng)條件，并對溶血磷脂進行紅外光譜和高效液相色譜分析，以期為開發(fā)大豆磷脂深加工產(chǎn)品提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆?jié)饪s磷脂 九三糧油工業(yè)集團；磷脂酶A1(lectiase ultra，酶比活力為9800U/mL) 丹麥Novo公司；正己烷、石油醚、無水乙醇(均為分析純) 天津市科密歐試劑有限公司；氫氧化鉀(分析純) 天津市大茂試劑廠。標準品1,2-二棕櫚酰-Sn-甘油-3-磷脂酰膽堿(PC)、1-棕櫚酰-Sn-甘油-3-磷脂酰膽堿(1-LPC) 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectrum GX2000傅里葉變換紅外光譜儀 美國PerkinElmer公司；1200S液相色譜儀 美國Agilent公司；HA121-50-01超臨界萃取設(shè)備 南通華安超臨界萃取有限公司；DF-1集熱式攪拌器 金壇虹盛儀器廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮儀器廠；TD4A離心機長沙英泰儀器廠。

1.3 酶解磷脂及脫油溶血磷脂的制備

用正己烷將適量的濃縮磷脂溶解，控制一定的磷脂質(zhì)量濃度、加酶量、反應(yīng)時間、加水量(pH6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液)，反應(yīng)溫度50℃，于集熱式攪拌器中(200r/min)反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)離心(4000r/min)和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(50℃，30min)脫溶后得到產(chǎn)品，用氫氧化鉀無水乙醇標準溶液測其酸值。

將在優(yōu)化條件下得到的酶解磷脂經(jīng)脫溶后，再經(jīng)超臨界CO2流體萃取得到脫油溶血磷脂(萃取條件為萃取溫度52℃、萃取壓力35MPa、萃取時間5.4h)。

1.4 磷脂酸值測定[14]

參照AOCS Ja6-55的方法測定。

1.5 單因素分析試驗設(shè)計

選取磷脂質(zhì)量濃度、反應(yīng)時間、加水量、加酶量4因素，以酸值為磷脂水解程度評價指標進行試驗。

1.6 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取磷脂質(zhì)量濃度、反應(yīng)時間、加水量、加酶量4因素，以酸值為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面試驗(表1)，研究制備溶血磷脂的最佳工藝參數(shù)。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and their levels tested in response surface analysis

1.7 溶血磷脂的紅外光譜分析

用傅里葉變換紅外光譜儀分析溶血磷脂官能團結(jié)構(gòu)。金屬陶瓷棒光源，中紅外碲鎘汞(MCT)檢測器，測定范圍為370～4000cm-1，分辨率為4cm-1，掃描次數(shù)為4次。

1.8 脫油溶血磷脂的液相色譜分析[15]

參照GB/T 22506—2008《酶改性磷脂中1-和2-溶血磷脂酰膽堿的測定》中方法。所用色譜柱為Agilent ZORBAX-NH2(250mm×4.6mm，5μm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素分析試驗

2.1.1 反應(yīng)時間對磷脂水解的影響

控制反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度50℃、磷脂質(zhì)量濃度20g/100mL、加水量100%、加酶量5%，結(jié)果如圖1所示。隨著反應(yīng)時間的增加，酶和磷脂結(jié)合幾率增大，反應(yīng)生成脂肪酸逐漸增多，但該條件下，16h后，反應(yīng)體系基本處于平衡狀態(tài)，酸值增加不明顯。但以濃縮磷脂的相對平均分子質(zhì)量800計算，加之其起始酸價，完全生成溶血磷脂的酸值應(yīng)為80mg KOH/g左右。在此研究體系中，考慮到該酶可能進一步催化1-?；?溶血磷脂水解生成其完全脫?；a(chǎn)物，從而水解產(chǎn)物酸值可能遠超過80mg KOH/g，因此其他單因素試驗反應(yīng)時間選為24h。

圖1 反應(yīng)時間對磷脂水解的影響Fig.1 Effect of reaction time on phospholipid hydrolysis

2.1.2 加酶量對磷脂水解的影響

控制反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度50℃、磷脂質(zhì)量濃度20g/100mL、加水量100%、反應(yīng)時間24h，結(jié)果如圖2所示。加酶量1%～3%時，酸值有顯著的變化。而加酶量3%～9%時，酸值的增加趨勢較前一范圍相對平緩一些?？赡苁怯捎诔跏紩r加酶量少，酶不能充分催化底物，當(dāng)加酶量增加，酶與底物的接觸機率增加，酸值變化較快。而加酶量達到一定值時，反應(yīng)達到平衡狀態(tài)。

圖2 加酶量對磷脂水解的影響Fig.2 Effects of enzyme dosage on phospholipid hydrolysis

2.1.3 磷脂質(zhì)量濃度對磷脂水解的影響

控制反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度50℃、加水量100%、加酶量5%、反應(yīng)時間24h，結(jié)果如圖3所示。磷脂質(zhì)量濃度15～25g/100mL時，水解產(chǎn)物的酸值顯著增加。而當(dāng)磷脂質(zhì)量濃度達到25g/100mL以后，酸值開始下降。可能原因是在較低的磷脂質(zhì)量濃度下，反應(yīng)體系易于分散均勻，酶分子與磷脂分子易于接觸，反應(yīng)程度較好。隨著磷脂質(zhì)量濃度的增大，磷脂分散困難，所以其酸值隨著磷脂質(zhì)量濃度的增大而降低。

圖3 磷脂質(zhì)量濃度對磷脂水解的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on phospholipid hydrolysis

2.1.4 加水量對磷脂水解的影響

控制反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度50℃、磷脂質(zhì)量濃度20g/100mL、加酶量5%、反應(yīng)時間24h，結(jié)果如圖4所示。加水量10%～20%時，酸值上升，而后隨加水量增加酸值降低?？赡茉蚴敲杆膺^程中，一方面，由于酶的反應(yīng)需要水的參與，以維持體系中磷脂酶的活性。當(dāng)水量過大時，將降低有機相的局部酶濃度，導(dǎo)致酸值逐漸降低。

圖4 加水量對磷脂水解的影響Fig.4 Effect of water content on phospholipid hydrolysis

2.2 響應(yīng)面分析試驗

根據(jù)表1的試驗設(shè)計，按照預(yù)定的反應(yīng)條件，對大豆?jié)饪s磷脂進行酶解反應(yīng)，響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2。據(jù)表2試驗結(jié)果，以酸值為響應(yīng)值(Y)，經(jīng)Design Expert 6.0統(tǒng)計軟件進行分析，依據(jù)編碼因素得到的回歸方程為：Y＝71.10－0.65A－2.14B＋2.80C＋10.88D－3.40A2＋0.77B2－2.03C2－2.56D2＋1.16AB＋3.58AC＋1.51AD－1.57BC－2.40BD－0.25CD。

表2 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

該模型的可靠性分析可從方差分析和確定系數(shù)兩方面考慮。對表2試驗結(jié)果進行方差分析(表3)，模型的P值小于0.05，所以回歸模型顯著，模型確定系數(shù)為R2＝0.9799，失擬項P＝0.0973＞0.05，表明失擬不顯著，該模型穩(wěn)定。在試驗設(shè)計范圍內(nèi)，可以對制備溶血磷脂條件進行有效的預(yù)測和分析。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression equation

由表3可知，在一次項中反應(yīng)時間和磷脂質(zhì)量濃度，二次項中加水量的平方、反應(yīng)時間的平方及加水量×磷脂質(zhì)量濃度對酸值影響顯著。依據(jù)回歸模型可以預(yù)測在反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時間13h、磷脂質(zhì)量濃度24g/100mL、加酶量4%、加水量17%條件下，溶血磷脂酸值最高可達75.8mg KOH/g。在該預(yù)測條件下驗證得溶血磷脂酸值為73.8mg KOH/g，與理論預(yù)測值相比，相對誤差小于5%。預(yù)測值與試驗值之間良好的擬合性證實了該模型的有效性。

2.3 溶血磷脂的紅外光譜分析

圖5 溶血磷脂紅外光譜圖Fig.5 FTIR spectra of lysophospholipids

溶血磷脂的定性分析采用紅外光譜法，其譜圖見圖5。參照陳斌斌等[16]在水相中制備的溶血磷脂紅外光譜圖，分析可知3386cm-1為—OH的伸縮振動峰；2930cm-1和2857cm-1為甲基、亞甲基C—H的伸縮振動峰；1738cm-1是—CO—O—中酯羰基C＝O伸縮振動引起；1224cm-1和1058cm-1分別是P＝O伸縮振動峰和P—O—C的伸縮振動峰。以上特征與溶血磷脂結(jié)構(gòu)相符。

2.4 脫油溶血磷脂的液相色譜分析

圖6 標準品PC和1-LPC液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of PC and 1-LPC standards

由圖6可知，1,2-二棕櫚酰-Sn-甘油-3-磷脂酰膽堿(PC)和1-棕櫚酰-Sn-甘油-3-磷脂酰膽堿(1-LPC)的出峰時間分別為6.895、11.062min。圖7為脫油溶血磷脂液相色譜圖。由外標法(其中PC標準曲線方程為y＝67666x－7807，R2＝0.9885；1-LPC標準曲線方程為y＝51651x－2482，R2＝0.9873)計算得該脫油溶血磷脂中磷脂酰膽堿和1-?；?溶血磷脂酰膽堿含量分別為6.79%和4.45%，表明利用磷脂酶A1酶解濃縮磷脂所生成的2-?；?溶血磷脂酰膽堿發(fā)生了?；灰?。

圖7 脫油溶血磷脂液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of defatted lysophospholipids

3 結(jié) 論

在正己烷有機相中，磷脂酶A1催化大豆?jié)饪s磷脂水解制備溶血磷脂的最佳工藝參數(shù)為反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時間13h、加酶量4%、加水量17%、磷脂質(zhì)量濃度24g/100mL，該條件下磷脂酸值為73.8mg KOH/g。該脫油溶血磷脂中磷脂酰膽堿和1-?；?溶血磷脂酰膽堿含量分別為6.79%和4.45%。

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Enzymatic Hydrolysis of Phospholipids for Preparing Lysophospholipids in Organic Phase

SUN Qing-rui，ZHANG Dong-jie*，LIU Zhi-ming，LU Bao-xin，WANG Qin，ZHANG Qing-rong
(College of Food, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

This study deals with the optimization of process conditions for the hydrolysis of phospholipids with phospholipase A1in hexane for preparing lysophospholipids using response surface methodology. A regression model for acid value of lysophospholipids was established with respect to four hydrolysis parameters. Meanwhile, lysophospholipids were analyzed by infrared spectroscopy and high performance liquid chromatography. The optimal process parameters for preparing lysophospholipids were determined as 50 ℃ of temperature, 13 h of reaction time, 4% of phospholipase A1, 17% of water, and 0.24 g/mL of substrate concentration. The acid value and the contents of phophatidylcholine and 1-acyl-lysophophatidylcholine in the obtained lysophospholipids were 73.8 mg KOH/g, 6.79% and 4.45%, respectively.

lysophospholipids；phospholipids；phospholipase A1；response surface methodology (RSM)

TS229

A

1002-6630(2012)18-0123-04

2011-07-21

黑龍江省農(nóng)墾總局科技攻關(guān)項目(HNKXIV-02-07)

孫清瑞(1976—)，男，講師，碩士，研究方向為食品加工技術(shù)與資源利用。E-mail：sqr16@163.com

*通信作者：張東杰(1966—)，男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：zdj66@yahoo.com.cn