王曉東，周大勇,*，朱蓓薇，呂艷紅

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.海洋食品教育部工程研究中心，遼寧 大連 116034；3.遼寧省海洋食品科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，遼寧 大連 116034)

黃海膽棘殼色素理化性質(zhì)和穩(wěn)定性的研究

王曉東1,2,3，周大勇1,2,3,*，朱蓓薇1,2,3，呂艷紅1

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.海洋食品教育部工程研究中心，遼寧 大連 116034；3.遼寧省海洋食品科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，遼寧 大連 116034)

對黃海膽棘殼色素理化性質(zhì)及穩(wěn)定性進行研究。結(jié)果表明：黃海膽棘殼色素在水、甲醇等極性溶劑中溶解性較好，在石油醚、正己烷等非極性溶劑中溶解性較差；在酸性環(huán)境中顯橘黃色，在堿性環(huán)境中顯土黃色；耐熱性較好，但耐光性較差；Na2SO3和山梨酸鉀既可引起色素顏色改變，又可降低色素穩(wěn)定性；H2O2和NaCl不改變色素顏色，但可降低色素穩(wěn)定性；高質(zhì)量濃度蔗糖可增強色素穩(wěn)定性；VC對色素起到護色增色作用。

黃海膽；色素；理化性質(zhì)；穩(wěn)定性

海膽棘殼是海膽加工中的副產(chǎn)物。研究表明，海膽棘殼中含有多種多羥基萘醌類色素(polyhydroxylated 1,4-naphthoquinone，PHNQ)[1-2]。PHNQ呈現(xiàn)出從橘黃到深紅的一系列顏色，具有抗菌[3]、保護心臟[4]和抗氧化[5]等諸多功效。近年來，由于合成色素的安全性受到挑戰(zhàn)[6]，天然色素越來越受到人們的關(guān)注[7]。以海膽棘殼為原料開發(fā)天然色素，既避免了資源的浪費，又提高了海膽加工業(yè)的附加值，具有很好的開發(fā)利用前景。黃海膽(Glyptocidaris crenularis)又名海刺猬，是大連地區(qū)主產(chǎn)的3種經(jīng)濟海膽之一[8]。本實驗以黃海膽棘殼色素為研究對象，對該色素的理化性質(zhì)和穩(wěn)定性進行研究，旨在為該色素的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃海膽(Glyptocidaris crenularis)于2009年7月采自大連黃海周邊海域。新鮮黃海膽破殼后取出海膽黃、臟器，剩余棘殼部分用水洗干凈，于40℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎后備用。

其他所用試劑均為分析純級，用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見全波長掃描儀 美國珀金埃爾默公司；酶標(biāo)定量檢測儀 瑞士Tcean公司；AB204-N電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多有限公司；PHS-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 黃海膽棘殼色素的提取

取經(jīng)干燥粉碎后的黃海膽棘殼粉末，用酸性乙醇溶液溶解，離心過濾后得深紅色澄清提取液，減壓濃縮得無乙醇味的濃縮液，經(jīng)水適當(dāng)稀釋后，離心過濾后用NKA-9大孔吸附樹脂進行吸附，再用乙醇洗脫，洗脫液濃縮凍干得色素粉末，低溫避光保存[9-10]。

1.3.2 黃海膽棘殼色素的溶解性

取去離子水、甲醇、無水乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、無水乙醚、氯仿、石油醚、正己烷各5mL，分別于室溫(15℃)溶解固體色素樣品至過飽和，離心取上清液觀察溶解狀況。

1.3.3 黃海膽棘殼色素母液的配制

室溫條件下精確稱取1.0g黃海膽棘殼色素，用去離子水溶解并定容至250mL，離心取上清液作為母液并避光保存。

1.3.4 黃海膽棘殼色素的紫外-可見光譜特征

室溫條件下將色素母液用去離子水稀釋至原質(zhì)量濃度的1/4，取適量用紫外-可見全波長掃描儀在波長200～600nm范圍內(nèi)進行掃描(去離子水做空白樣)。

1.3.5 pH值對黃海膽棘殼色素顏色的影響

室溫條件下分別配制pH值為2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.6的緩沖溶液各50mL，然后按色素母液與緩沖溶液體積比為1:9的比例配10mL溶液于塑料具塞試管中，充分搖勻，觀察色素顏色有無變化。

1.3.6 光照對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響

室溫條件下將色素母液用去離子水稀釋至原質(zhì)量濃度的1/4，各取10mL于兩支玻璃具塞試管中，分別在自然光和暗處放置2周。定期用酶標(biāo)定量檢測儀測定其在475nm波長處的吸光度，計算保存率。

式中：A為某時刻特征吸收波長處的色素溶液吸光度；A0為色素溶液在特征吸收波長處的初始吸光度。1.3.7 溫度對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響

室溫條件下將色素母液用去離子水稀釋至原質(zhì)量濃度的1/4，各取10mL于4支塑料具塞試管中，分別置于20、40、60、80℃的恒溫水浴鍋中保溫(避光)，每隔一定時間取出冷卻，用酶標(biāo)定量檢測儀測定其在475nm波長處的吸光度，計算保存率。

1.3.8 H2O2和Na2SO3對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響

室溫條件下分別配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的H2O2溶液和不同質(zhì)量濃度的Na2SO3溶液。然后按色素母液與緩沖溶液體積比為1:9的比例配10mL溶液于塑料具塞試管中，充分混勻，避光放置，定期用酶標(biāo)定量檢測儀測定其在475nm波長處的吸光度，計算保存率。

1.3.9 部分食品添加劑對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響

室溫下分別配制不同質(zhì)量濃度的NaCl、蔗糖、山梨酸鉀、VC溶液，然后按色素母液與緩沖溶液體積比為1:9的比例配10mL溶液于塑料具塞試管中，充分混勻，避光放置，定期用酶標(biāo)定量檢測儀測定其在475nm波長處的吸光度，計算保存率。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析借助SPSS 15.0 分析軟件(SPSS Inc. Chicago，IL，USA)實現(xiàn)。組間差異性檢驗采用單因素方差分析中的LSD法完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃海膽棘殼色素的溶解性

凍干后的黃海膽棘殼色素為暗紅色的固體粉末。15℃條件下色素的去離子水飽和溶液呈黑紅色，甲醇、無水乙醇飽和溶液呈深紅色，丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿的飽和溶液較淺，呈橘黃色，而石油醚、正己烷的飽和溶液基本無色。色素在極性大的溶劑中溶解性較好，這是因為黃海膽棘殼色素的主要成分是一些多羥基1,4-萘醌類物質(zhì)，極性較大，所以易溶于水等極性較強的溶劑。

2.2 黃海膽棘殼色素的紫外-可見吸收光譜

低質(zhì)量濃度的黃海膽棘殼色素水溶液呈現(xiàn)橘黃色。如圖1所示，黃海膽棘殼色素的水溶液分別在波長272、325、475nm附近出現(xiàn)3個吸收峰，符合PHNQ類化合物的典型光譜吸收特征：有3～4個明顯的吸收峰，其中可見區(qū)波長處最大的吸收峰多出現(xiàn)在450～550nm處[2]。本實驗制備的是粗色素，可能含有蛋白質(zhì)等的非色素物質(zhì)。非色素物質(zhì)的吸收波長多集中在紫外區(qū)，為了排除其對測定結(jié)果的干擾，選取可見光區(qū)的最大吸收波長475nm為黃海膽棘殼色素的檢測波長，用于對色素穩(wěn)定性的分析。

圖1 黃海膽棘殼色素的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectrum of sea urchin pigments

2.3 pH值對黃海膽棘殼色素顏色的影響

實驗現(xiàn)象顯示，黃海膽棘殼色素水溶液的顏色會隨著溶液pH值的不同而發(fā)生變化。色素水溶液顏色在pH＜6時變化不明顯，呈橘黃色，pH7～9 時呈土黃色，pH10時呈深土黃色，pH10.6時呈暗黃色，其中在pH8～10時溶液中立即產(chǎn)生絮狀物。文獻表明，PHNQ在高pH值下會失去不同數(shù)目的羥基氫離子而以陰離子的形式存在[11]，這可能是色素隨pH值變化而變色的原因。產(chǎn)生絮狀物的原因可能是色素中含有的非色素物質(zhì)在堿性條件下不溶造成的。另外當(dāng)pH＜10.0時，某些PHNQ在有氧情況下穩(wěn)定性很差，會導(dǎo)致氧化速率加快[11]。因此不論從利用色素橘黃色色調(diào)的角度講，還是從穩(wěn)定性的角度講，黃海膽棘殼色素適宜在偏酸性環(huán)境中應(yīng)用。2.4 光照對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響

圖2 光照對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of light on stability of sea urchin pigments

隨保存時間延長，色素在光照處和暗處的保存率都呈下降趨勢，外觀顏色變淺，同時還伴隨有一些褐色絮狀物的產(chǎn)生，但在光照處變化的更為明顯。由圖2可知，同樣放置14d后，暗處的色素溶液保存率下降至46.07%，而光照處的色素溶液保存率下降至21.83%。

Lebedev等[12]在研究中發(fā)現(xiàn)，以海膽色素A(2,3,5,7, 8-五羥基-1,4-萘醌)為代表的PHNQ存在著原理為自由基反應(yīng)的自氧化現(xiàn)象，生成含4個羰基的終產(chǎn)物。終產(chǎn)物因失去羥基而極性下降，水溶性也相應(yīng)降低，這可能是色素水溶液在保存過程中顏色變淺并出現(xiàn)絮狀物的原因。而在光的輻射作用下，水會產(chǎn)生水合電子、氫原子、過氧化氫等物質(zhì)，在有氧條件下，水合電子會轉(zhuǎn)化為超氧陰離子，氫原子會轉(zhuǎn)化為過氧化氫自由基(HO2·)，再部分轉(zhuǎn)化為超氧陰離子自由基[13]，從而加速了色素的氧化進程，所以黃海膽棘殼色素在保藏和使用時要盡量避免長時間的與光直接接觸。

2.5 溫度對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響

圖3 溫度對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of temperature on stability of sea urchin pigments

由圖3可知，保存溫度越高，黃海膽棘殼色素的穩(wěn)定性越差。保溫7h后，20、40、60、80℃條件下色素的保存率分別為94.59%、86.75%、81.29%和79.02%，且80℃條件下試管底部明顯地出現(xiàn)了絮狀物。出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能是高溫加快了多羥基萘醌類物質(zhì)的自氧化速率，也可能是萘醌類物質(zhì)在高溫中發(fā)生了熱降解。2.6 H2O2和Na2SO3對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響

圖4 H2O2對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of H2O2 on stability of sea urchin pigments

由圖4可知，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)H2O2對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響不大，但隨著H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，色素的穩(wěn)定性下降明顯，并有少量沉淀生成。不包括對照在內(nèi)，色素在質(zhì)量分?jǐn)?shù)由低到高的H2O2溶液中保存7h后，保存率分別是94.68%、89.07%、88.96%和82.19%。H2O2是一種強氧化劑，可分解出羥自由基[15]，加速棘殼色素的氧化進程。因此，黃海膽棘殼色素在保藏及使用時要盡量避免與高濃度的氧化物質(zhì)相接觸。

Na2SO3的加入使黃海膽棘殼色素溶液的顏色由橘黃色變?yōu)橥咙S色。表1的保存率數(shù)據(jù)顯示，Na2SO3的加入還會顯著降低色素的穩(wěn)定性。Na2SO3是強堿弱酸鹽，溶液顯堿性，棘殼色素在堿性溶液中會發(fā)生顏色改變和穩(wěn)定性降低。因此，黃海膽棘殼色素使用時不能與Na2SO3同時添加。

表1 Na2SO3對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響(±s，n＝3) Table 1 Effect of Na2SO3 on stability of sea urchin pigments (±s，n＝3)

表1 Na2SO3對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響(±s，n＝3) Table 1 Effect of Na2SO3 on stability of sea urchin pigments (±s，n＝3)

注：同行小寫字母不同，表示差異顯著(P＜0.05)；同列大寫字母不同，表示差異顯著(P＜0.05)。下同。

保存率/%時間/h Na2SO3質(zhì)量濃度/(g/L) 0 0.045 0.9 1.35 1.8 1 99.42±0.25aAB98.95±0.84aA 100.34±2.61aA100.23±0.76aA100.49±0.62aA 2 99.87±0.61aA 98.93±0.56aA 98.37±2.23aAB99.11±1.45aA99.37±1.33aA 3 98.65±1.15aAB96.59±1.39abB95.90±0.71bBC95.25±1.34bB95.22±1.50bB 5 97.45±1.37aBC94.95±0.21abB93.58±0.54bCD 94.07±1.98bB90.08±2.62cC 7 95.88±2.24aC 92.50±2.21bC 91.31±0.46bcD 89.09±1.82cC89.54±1.14cC

2.7 食品添加劑對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響

加入山梨酸鉀使黃海膽棘殼色素溶液的橘黃色變暗，且由表2可知，添加山梨酸鉀的色素溶液穩(wěn)定性降低。原因同樣可能是顯堿性的山梨酸鉀溶液使多羥基萘醌類色素的自氧化程度加重，所以該色素不能與山梨酸鉀混合使用。

NaCl和蔗糖的加入不會對黃海膽棘殼色素的顏色造成影響。但隨著添加物質(zhì)量濃度的增加，NaCl會降低色素的穩(wěn)定性(表3)；高質(zhì)量濃度蔗糖則略增加色素的穩(wěn)定性(表4)，其原因可能是高質(zhì)量濃度糖液中，水分活度降低，溶解氧減少，從而減慢了黃海膽棘殼色素的自氧化速度[16]。

由表5可知，當(dāng)VC的質(zhì)量濃度大于0.045g/L時，可明顯起到護色增色作用。VC是一種抗氧化劑，可阻止色素的氧化進程，起到護色作用。發(fā)色團如羰基等使物質(zhì)具有顏色，助色團如羥基等會增大發(fā)色團的發(fā)色能力，若一個化合物的分子中含有數(shù)個發(fā)色團和助色團，而且發(fā)色團之間或是發(fā)色團和助色團之間形成共軛體系時，化合物的顏色就會加深[17]。多羥基萘醌類色素的分子中同時含有發(fā)色團和助色團，色素溶液顏色加深可能是VC的存在阻止了羥基被氧化而使共軛作用發(fā)生所致，所以黃海膽棘殼色素在使用當(dāng)中可以選擇VC作為它的護色增色劑。

表2 山梨酸鉀對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響(±s，n＝3)Table 2 Effect of potassium sorbate on stability of sea urchin pigments (±s，n＝3)

表2 山梨酸鉀對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響(±s，n＝3)Table 2 Effect of potassium sorbate on stability of sea urchin pigments (±s，n＝3)

保存率/%時間/d 山梨酸鉀質(zhì)量濃度/(g/L) 0 0.18 0.45 0.9 1.35 1.8 1 97.97±0.95aA 96.28±1.42abA 94.13±1.85bA 94.63±1.24bA 94.39±2.86bA 90.78±2.00cA 2 98.34±3.01aA 87.96±2.66bB 74.01±0.55cB 74.08±3.50cB 68.45±1.45dB 70.16±1.93cdB 3 95.88±3.43aA 74.23±2.99bC 60.42±1.76cC 54.27±0.74dC 49.12±1.92eC 47.20±1.27eC 7 81.53±1.72aB 46.70±1.08bD 35.68±0.16cD 37.57±1.65cD 36.92±1.58cD 35.08±1.99cD 14 65.82±2.11aC 35.90±1.74bE 35.86±1.58bD 39.41±2.18bD 36.32±1.41bD 34.26±1.31bD

表3 NaCl對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響(±s，n＝3)Table 3 Effect of NaCl on stability of sea urchin pigments(±s，n＝3)

表3 NaCl對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響(±s，n＝3)Table 3 Effect of NaCl on stability of sea urchin pigments(±s，n＝3)

保存率/%時間/d NaCl質(zhì)量濃度/(g/100mL) 0 0.9 1.8 4.5 9.0 13.5 1 99.93±2.37aA 97.26±2.01bA 97.86±0.95abA 96.29±0.64bcA 96.94±0.29bcA 94.63±1.30cA 2 97.03±4.18aAB 92.34±1.74bB 92.78±1.30bB 90.28±0.38bB 90.47±1.92bB 85.23±1.15cB 3 93.06±1.07aB 86.11±1.26bC 84.61±1.94bC 85.04±2.07bC 75.43±2.00cC 71.33±1.62dC 7 74.68±1.63aC 69.06±1.57bD 64.90±2.00cD 59.23±1.50dD 54.74±2.00eD 48.89±1.81fD 14 56.50±2.08aD 52.55±2.23bE 46.63±1.98cE 44.44±2.07cdE 41.33±0.88dE 37.66±1.37eE

表4 蔗糖對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響(±s，n＝3)Table 4 Effect of cane sugar on stability of sea urchin pigments(±s，n＝3)

表4 蔗糖對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響(±s，n＝3)Table 4 Effect of cane sugar on stability of sea urchin pigments(±s，n＝3)

保存率/%時間/d 蔗糖質(zhì)量濃度/(g/100mL) 0 0.9 4.5 9.0 18.0 27.0 1 94.43±0.56bA 98.45±2.48aA 97.52±2.32abA 98.92±2.13aA 98.33±1.11aA 98.03±2.13aA 2 87.53±2.66bB 92.39±2.96aA 93.24±1.63aB 93.07±2.14aB 93.85±2.70aB 94.19±2.57aB 3 88.68±2.67aB 86.12±4.90aB 85.55±1.06aC 88.51±1.74aC 87.81±1.90aC 87.38±1.54aC 7 78.90±2.35aC 74.28±4.44bC 74.61±1.67abD 76.56±1.68abD 77.58±1.61abD 77.93±1.36abD 14 57.75±0.76bcD 54.28±0.47dD 55.75±1.44cdE 60.14±1.64abE 61.58±2.31aE 60.08±1.59abE

表5 VC對黃海膽棘殼色素穩(wěn)定性的影響Table 5 Effect of VC on stability of sea urchin pigments

3 結(jié) 論

黃海膽棘殼色素在極性大的溶劑如去離子水、甲醇、乙醇中溶解性較好，在極性小的溶劑如石油醚、正己烷中溶解性差。色素在pH≥7的緩沖溶液中顏色會隨pH值變化而發(fā)生變化。色素的耐熱性較好，但耐光性較差。Na2SO3和山梨酸鉀會改變色素的顏色并使色素穩(wěn)定性下降；H2O2、NaCl和蔗糖不會對色素顏色構(gòu)成不良影響，但前兩者會使色素穩(wěn)定性下降。VC對色素有護色增色作用。

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Physico-chemical Properties and Stability of Pigments from Spine and Shell of Sea UrchinGlyptocidaris crenularis

WANG Xiao-dong1,2,3，ZHOU Da-yong1,2,3,*，ZHU Bei-wei1,2,3，LYan-hong1
(1. School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；
2. Engineering Research Center of Seafood of Ministry of Education, Dalian 116034, China；
3. Liaoning Province Key Laboratory of Seafood Science and Technology, Dalian 116034, China)

The present study aimed to characterize physicochemical properties and stability of pigments extracted from the spine and shell of sea urchin (Glyptocidaris crenularis). Our results showed that the pigments had relatively high solubility in polar solvents such as water and methanol but had relatively low solubility in non-polar solvents such as light petroleum and hexane. The pigments showed orange color in acidic conditions but yellowish brown color in basic conditions. The pigments were relatively stable to heat but unstable to light. Na2SO3 and potassium sorbate could not only cause changes in the color but also decrease the stability of the pigments. H2O2 and NaCl could not cause any changes in the color but decrease the stability of the pigments. High concentrations of cane sugar could enhance the stability of the pigments. Vitamin C could protect and enhance the color of the pigments.

Glyptocidaris crenularis；pigment；physico-chemical properties；stability

TS254.9

A

1002-6630(2012)01-0044-05

2011-01-07

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2008BAD94B07)；遼寧省博士科研啟動基金項目(20091002)

王曉東(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)品加工理論與技術(shù)。E-mail：wangcy451@163.com

*通信作者：周大勇(1977—)，男，講師，博士，研究方向為水產(chǎn)品加工理論與技術(shù)。E-mail：zdyzf1@163.com