賈秀芬

（聊城職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，山東 聊城 252000）

槲皮素對小鼠1-細(xì)胞胚胎體外發(fā)育能力的影響

賈秀芬

（聊城職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，山東 聊城 252000）

目的 為完善小鼠早期胚胎體外培養(yǎng)體系，了解槲皮素對小鼠1-細(xì)胞胚胎體外發(fā)育的影響。方法 以CZB為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，添加不同濃度（500、50、5、1、0.5、0.2、0.1 μm）的槲皮素作為試驗組，添加等量二甲基亞砜（DMSO）作為對照組，觀察不同濃度槲皮素對胚胎發(fā)育到囊胚各階段的影響。結(jié)果 當(dāng)槲皮素濃度超過50 μm時，對胚胎發(fā)育有毒性效應(yīng)；0.1～1 μm濃度槲皮素對胚胎發(fā)育有促進(jìn)作用，特別是0.5 μm槲皮素能明顯提高胚胎的囊胚形成率。結(jié)論 0.5 μm槲皮素能促進(jìn)小鼠早期胚胎的體外發(fā)育。

槲皮素；細(xì)胞胚胎；體外發(fā)育

在體內(nèi)，胚胎發(fā)育過程中會通過各種酶促反應(yīng)和代謝途徑產(chǎn)生內(nèi)源性的活性氧簇（ROS），即在有氧代謝過程中會產(chǎn)生ROS。不同階段產(chǎn)生不同量的ROS，而且胚胎發(fā)育的各階段對ROS的敏感性也不同，如果不能迅速、有效地去除，ROS能破壞一系列的大分子物質(zhì)，甚至導(dǎo)致胚胎的死亡。但體內(nèi)存在著有效去除ROS的酶促機制和非酶促機制。包括ROS清除酶像超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶，以及一些小分子量物質(zhì)如谷胱甘肽、維生素E、維生素C、尿酸等。而在體外不存在這樣的保護機制，因此，筆者在體外胚胎培養(yǎng)液中加入抗氧化劑——槲皮素，觀察它對胚胎發(fā)育的影響。

槲皮素（quercetin）屬類黃酮物質(zhì)中的黃酮醇，它是人類膳食中常見的類黃酮物質(zhì)，也是一些中草藥的有效成分。據(jù)文獻(xiàn)報道，槲皮素在體外可通過直接清除活性氧自由基、螯合金屬離子、抑制LDL及DNA氧化損傷，發(fā)揮其抗氧化作用[1]。在體內(nèi)，槲皮素、維生素C灌胃后大鼠外周血總抗氧化能力明顯上升且程度相近，而維生素E灌胃前后外周血總抗氧化能力無明顯變化。在體外，槲皮素被細(xì)胞胚胎吸收后抗氧化能力強于傳統(tǒng)的抗氧化劑維生素C、維生素E[2]。同樣是抗氧化劑，考慮到維生素E和維生素C對胚胎發(fā)育的影響不大，故尋找槲皮素促進(jìn)胚胎發(fā)育的最佳濃度，以提高胚胎體外發(fā)育能力。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

為昆明系性成熟小鼠，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院實驗動物中心（動物質(zhì)量合格證號：醫(yī)動字第09-2-1號）。小鼠飼養(yǎng)采用自由取食和飲水方式，人工控溫22～24℃，光照周期為12 h光照、12 h黑暗。

1.2 主要試劑

所用試劑除孕馬血清促性腺激素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（HCG）購自寧波第二激素廠外，其余均購自Sigma公司，CZB培養(yǎng)液本實驗室自配。

1.3 實驗方法

1.3.1 超排和胚胎的收集 雌性小鼠腹腔注射PMSG7.5 IU/只，48 h后腹腔注射HCG7.5 IU/只，進(jìn)行超數(shù)排卵[3]，并與雄鼠1∶1合籠，注射HCG 21～24 h后將見栓鼠采用脫頸法處死，體視顯微鏡在Hepes-CZB操作液中劃開輸卵管壺腹部，收集受精卵。被顆粒細(xì)胞包圍的受精卵，用0.1%的透明質(zhì)酸酶處理，再用Hepes-CZB洗3次后進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2 實驗分組 因槲皮素為不溶于水的抗氧化劑，故將其溶于二甲基亞砜中，使二甲基亞砜濃度保持在1/1 000，再加入CZB 培養(yǎng)液中，使槲皮素濃度分別達(dá)到 500、50、5、1、0.5、0.2、0.1 μm作為試驗組，對照組則以加入等量二甲基亞砜作對照，基礎(chǔ)培養(yǎng)液CZB則為空白組。

1.3.3 胚胎培養(yǎng) 將20 μl微滴覆以石蠟油，在5%CO2、95%空氣、37℃飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中平衡4～5 h，每滴最多培養(yǎng)10枚胚胎。每隔24 h觀察一次，記錄胚胎發(fā)育情況，直至144 h結(jié)束。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析（見表1）

表1 不同濃度槲皮素對1-細(xì)胞胚胎體外發(fā)育的影響[n（%）]

由表1可知，在發(fā)育到二細(xì)胞時，除槲皮素濃度為50 μm的發(fā)育率低于空白組外，其余試驗組各濃度胚胎發(fā)育率均高于空白組，以槲皮素濃度為1 μm發(fā)育率最高，然而無顯著性差異。四細(xì)胞發(fā)育率以1 μm和0.5 μm濃度發(fā)良率較高，然而無顯著性差異。50 μm和0.5μm濃度的四細(xì)胞發(fā)育率比較有顯著性差異。八細(xì)胞-桑椹胚發(fā)育率以0.5 μm濃度最高，但無顯著性差異。囊胚發(fā)育率除50 μm濃度低于空白組外，其余各濃度胚胎發(fā)育率均高于空白組，以0.5 μm濃度最高，同空白組和試驗組50 μm濃度比較有顯著性差異。500 μm濃度的槲皮素處理的受精卵，停止在1-細(xì)胞不發(fā)育，而且細(xì)胞膜出現(xiàn)許多小泡（見圖1），顯示了該藥的毒性效應(yīng)。空白組包括正常受精卵，二細(xì)胞胚胎，四細(xì)胞胚胎（×100），八細(xì)胞胚胎-桑葚胚及囊胚（正在孵出的及已經(jīng)孵出的，×400）胚胎發(fā)育的各個時期見圖2。

圖1 500 μm濃度的槲皮素處理的受精卵細(xì)胞膜（×300）

圖2 空白組胚胎發(fā)育的不同階段

3 討論

通過研究體內(nèi)發(fā)育的小鼠卵母細(xì)胞及早期胚胎中H2O2含量發(fā)現(xiàn)：未受精的卵母細(xì)胞中H2O2水平較低，胚胎發(fā)育各階段的早期胚胎細(xì)胞中H2O2水平高于以后發(fā)育的任何時期的水平，離體培養(yǎng)的二細(xì)胞中期小鼠胚胎H2O2水平上升，以后高居不下[4]。本實驗在CZB培養(yǎng)液中添加不同濃度的槲皮素觀察對受精卵體外發(fā)育的影響。濃度選擇在50 μm以下，是因為有研究[5]表明，該濃度以上對細(xì)胞有毒性效應(yīng)。通過本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素在0.1～1 μm濃度段對胚胎發(fā)育有明顯促進(jìn)作用，特別是0.5 μm濃度，囊胚發(fā)育率較高，表明抗氧化能力最佳。這一實驗結(jié)果與許多實驗結(jié)果一致。同時試驗組四細(xì)胞發(fā)育率同空白組相比有顯著性差異，說明槲皮素的抗氧化作用主要在早期胚胎發(fā)育中起作用，特別是對二細(xì)胞、四細(xì)胞發(fā)育的影響，這可能與二細(xì)胞的發(fā)育阻滯相關(guān)聯(lián)。在八細(xì)胞-桑椹胚發(fā)育率上，僅0.5 μm濃度表現(xiàn)為促進(jìn)作用，其余試驗組濃度均低于空白組，到囊胚發(fā)育率上試驗組各濃度（50 μm濃度除外）卻又高于空白組，這一現(xiàn)象有待進(jìn)一步研究。盡管高濃度槲皮素不利于胚胎發(fā)育，本實驗還是選擇了500 μm濃度觀察對胚胎的毒性效應(yīng)。在500 μm時，發(fā)現(xiàn)受精卵停止在1-細(xì)胞期，且細(xì)胞膜起泡。如Yuling[6]等報道，以2，4-D作為活性氧的來源，精子細(xì)胞數(shù)目及其活力明顯降低，精子細(xì)胞的形態(tài)也發(fā)生改變。當(dāng)同時加入槲皮素時，結(jié)果發(fā)生明顯改變：精子細(xì)胞數(shù)目明顯增加，較多細(xì)胞保持了質(zhì)膜的完整。說明槲皮素通過減少細(xì)胞內(nèi)活性氧水平及質(zhì)膜過氧化作用發(fā)揮其抗氧化能力。據(jù)報道[7]，槲皮素能抑制H2O2誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡，保持細(xì)胞形態(tài)正常，其原理是槲皮素主要清除胞內(nèi)異常增多的自由基。周蕾等[8]報道，槲皮素對柔紅霉素致大鼠心肌細(xì)胞損傷的保護作用其機理可能與抗氧化作用有關(guān)。陳中華等[9]報道，槲皮素對紫外線損傷NIH3T3細(xì)胞的保護作用是通過清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基，維持細(xì)胞的線粒體膜電位，抑制細(xì)胞凋亡。曹文軍等[10]證實，槲皮素可顯著提高體內(nèi)一種重要的清除自由基的酶GSH-Px活性，從而保護缺血再灌注對心肌損傷。所有這些文獻(xiàn)，都充分證明了槲皮素對細(xì)胞的保護作用與其抗氧化特性相關(guān)，與本實驗結(jié)果一致，從而為槲皮素應(yīng)用于胚胎體外培養(yǎng)提供了依據(jù)。目前，胚胎體外培養(yǎng)體系雖有所改善，但至今仍不是最好的培養(yǎng)條件，不能代替生殖管道內(nèi)的有利條件。盡管哺乳動物的胚胎有明顯的可塑性，能在很大范圍的培養(yǎng)條件下形成囊胚，然而亞培養(yǎng)條件可能不僅會破壞植入前胚胎的基因表達(dá)模式，而且會影響出生后的發(fā)育，甚至后代的生長和生理。自然界中天然的槲皮素為胚胎培養(yǎng)體系的完善提供了廣闊前景，故需將槲皮素對胚胎發(fā)育的促進(jìn)機制進(jìn)行詳盡的探討。

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[9]陳中華，張秀珍.槲皮素對紫外線損傷NIH3T3細(xì)胞的保護作用研究[J].生命科學(xué)儀器，2008，6（5）：27～29.

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1671-1246（2012）07-0114-02