莫學(xué)靚 雷建軍 唐志晗 王佐

BRAF表達(dá)量與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性程度的相關(guān)性研究

莫學(xué)靚 雷建軍 唐志晗 王佐

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，其發(fā)病機(jī)制并不十分清楚。各種原癌基因與抑癌基因的突變或表達(dá)量的改變。BRAF基因，與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)生密切相關(guān)。但BRAF表達(dá)量是否與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的惡性程度相關(guān)，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，本研究在48例惡性程度不同的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)了BRAF基因的表達(dá)量改變。結(jié)果顯示BRAF基因在惡性程度高的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中表達(dá)量較高，這提示我們BRAF基因的表達(dá)量可能可作為腫瘤惡性程度和預(yù)后的一個(gè)判斷指標(biāo)，也為干預(yù)BRAF基因表達(dá)，抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡變提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤;BRAF;RAS

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤［1］，其發(fā)病發(fā)生原因復(fù)雜，可能與原癌基因的突變，拷貝數(shù)改變等遺傳因素相關(guān)。已有研究證實(shí)，EGFR，PDGFRA，PDGF，PDGFR，CDK4，IDH1，IDH2，TP53，CDKN2A，PTEN等基因的突變，缺失或表達(dá)量的改變與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤密切相關(guān)［2-6］。BRAF，又名鼠類肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌同源體B1，是RAF基因家族成員，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶類，其活化后可激活MEK(ERK激酶)，向MAPK信號(hào)通路下游傳遞細(xì)胞有絲分裂信號(hào)，導(dǎo)致腫瘤形成。BRAF基因的改變?cè)谠S多腫瘤中和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤已經(jīng)報(bào)道，但與腫瘤惡性沉淀的的關(guān)系報(bào)道并不多見(jiàn)，本研究在48例惡性程度不同的膠質(zhì)細(xì)胞中檢測(cè)

BRAF的表達(dá)變化，探討B(tài)RAF表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性程度的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 選取2007年1月至2011年1月間在永州市人民醫(yī)院(現(xiàn)更名為永州市中心醫(yī)院)行手術(shù)切除的48例神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤作為研究組，所有病例未進(jìn)行術(shù)前化療。所有病例的診斷依據(jù)患者的臨床資料和術(shù)后病理的確認(rèn)。腫瘤切除后用于石蠟包埋進(jìn)行病理診斷和免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.2 臨床資料收集 根據(jù)患者的病例資料和病理診斷，詳細(xì)記錄以下臨床資料:姓名，性別，年齡，腫瘤大小，腫瘤臨床分期，淋巴轉(zhuǎn)移，腫瘤分期采用世界衛(wèi)生組織AJCC分期系統(tǒng)。

1.3 免疫組織化學(xué) 采用免疫組織化學(xué)方法，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中BRAF的表達(dá)狀況。具體方法如下:常規(guī)應(yīng)用二甲苯脫蠟，梯度酒精脫蠟。蒸餾水新鮮配制3%H2O2室溫下滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，蒸餾水洗2 min×3次，微波修復(fù)抗原:將切片浸入0.01 m枸櫞酸鹽緩沖溶液(PH6.0)，微波爐中高火加熱5 min，冷卻10 min，自然冷卻，0.1 m PBS洗5 min ×3次，滴加非免疫血清封閉液，室溫下封閉30 min，甩去多余的液體，滴加抗兔源性BRAF抗體(Abcam公司)，4℃濕盒過(guò)夜，陰性對(duì)照滴加兔IgG，0.1 m PBS洗5 min×3次，分別滴加生物素化抗兔IgG二抗(sigma公司)，37℃放置20 min，0.1 mPBS洗3 min min×3次，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37℃孵育20 min，0.1 m PBS洗3 min×3次，滴加新鮮配制DAB顯色劑，鏡下控制染色，充分水沖洗終止反應(yīng)，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)脂封片。在保持顯微鏡下相同光強(qiáng)度，每張切片拍攝5個(gè)視野的照片。免疫組化染色圖像使用Image J軟件進(jìn)行分析，進(jìn)行光密度測(cè)定分析，測(cè)定平均光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。均數(shù)間的比較采用方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料 本研究中共有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者48例，其中男性37例，女11例，年齡范圍24歲～71歲(平均54.4±17.2歲)，所有病例均為住院患者并經(jīng)術(shù)后病理確診。根據(jù)世界衛(wèi)生組織分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期3例，Ⅱ期15例(I+Ⅱ期為高分化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤)，Ⅲ期7例，IV期23例(III+IV期為低分化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤)，一般臨床資料見(jiàn)表1。

表1 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的一般臨床資料

2.2 BRAF基因在低分化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)在所有48例神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中，我們使用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)了BRAF基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示，BRAF在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中都呈現(xiàn)胞漿分布，同時(shí)，低分化膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的信號(hào)明顯強(qiáng)于高分化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤(圖1)。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

3 討論

BRAF，又名鼠類肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌同源體B1，是RAF基因家族成員，位于人染色體7q34，包含18個(gè)外顯子，編碼分子量為94kD的蛋白質(zhì)，由783個(gè)氨基酸殘基組成，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶家族，在MAPK信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用［7］。BRAF是RET和RAS的下游蛋白激酶，RET可以與細(xì)胞膜上的特異受體結(jié)合，激活鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白R(shí)AS的GDP解離而結(jié)合GTP，從而活化RAS［8］;活化的RAS進(jìn)一步與絲/蘇氨酸蛋白激酶BRAF結(jié)合，從而激活BRAF，進(jìn)而磷酸化MAPK激酶，產(chǎn)生聯(lián)級(jí)反應(yīng)，最終活化ERKs，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核。ERKs可以激活核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子如c-fos、c-Jun、Elk-1、cmyc等，從而調(diào)節(jié)參與細(xì)胞增殖與分化的相關(guān)基因，在腫瘤發(fā)生中產(chǎn)生重要調(diào)控作用［9］。

RAS基因突變以及RAS/RAF信號(hào)通路的激活在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中其中重要的作用［10］，本研究在48例神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣本中，探討了膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性程度與BRAF表達(dá)量的相關(guān)性。我們的結(jié)果提示，惡性程度越高的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤BRAF表達(dá)量越高。BRAF的激活有可能激活下游MAPK信號(hào)通路，從而引起細(xì)胞增殖與分化相關(guān)基因表達(dá)失調(diào)，導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)生。該結(jié)果也進(jìn)一步提示，RAS/BRAF信號(hào)通路可能可以作為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤預(yù)后的判斷指標(biāo)［11］。同時(shí)，針對(duì)BRAF基因作為靶點(diǎn)的治療手段是否能抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的惡性程度還有待進(jìn)一步研究。

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421001衡陽(yáng)，南華大學(xué)心血管疾病研究所(莫學(xué)靚雷建軍 唐志晗 王佐);永州市中心醫(yī)院(莫學(xué)靚)

圖1 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤標(biāo)本中BRAF免疫染色(400X)

A:高分化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤，B:低分化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤

圖2 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織標(biāo)本BRAF免疫染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖

*:與高分化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤比較P＜0.05