朱祥 朱靈 范鈺

RNAi沉默核因子-B亞單位p65表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞侵襲

朱祥 朱靈 范鈺

目的 采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)敲除胃癌細(xì)胞核因子-kappa B(nuclear factor-B，NF-B)亞單位p65后，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲力的影響。方法 采用p65小干擾RNA (small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后，采用Western Blot檢測(cè)細(xì)胞p65蛋白，分別采用軟瓊脂集落培養(yǎng)試驗(yàn)和Ttanswell檢測(cè)癌細(xì)胞增殖和侵襲能力。結(jié)果 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞p65蛋白明顯被抑制，且呈濃度依賴性。與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞所形成的軟瓊脂集落數(shù)和穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，且呈時(shí)間和濃度依賴性。結(jié)論 針對(duì)NF-B重要亞單位的p65 siRNA可抑制胃癌細(xì)胞侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，NF-B途徑的激活是胃癌等腫瘤細(xì)胞生存的重要機(jī)制之一。

胃腫瘤;核因子;p65;侵襲

核因子-kapp B(nuclear factor-B，NF-B)是一個(gè)關(guān)鍵的基因表達(dá)調(diào)控子。是與細(xì)胞增殖、凋亡等有關(guān)［1］。NF-B由許多同型二聚體組成，包括p50，p52，p65(RelA)，RelB和c-Rel亞單位［2］。一般情況下，NF-B在大多數(shù)細(xì)胞靜息不活動(dòng)，當(dāng)遇到一些刺激因子時(shí)，易位到核內(nèi)而發(fā)揮作用［3］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中NF-B激活，并與腫瘤侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵潤(rùn)深度、腹膜轉(zhuǎn)移正相關(guān)［4］。但在胃癌細(xì)胞中NF-B可能的侵襲作用尚不清楚。

本研究采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)，以針對(duì)NF-B亞單位p65的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞AGS，觀察了對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲的影響。

1 方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染處理 人胃癌AGS細(xì)胞在含10%胎牛牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境的條件下連續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，將濃度為1.0×105/ml的細(xì)胞接種于24或6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜。次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分組:①空白對(duì)照組。②脂質(zhì)體對(duì)照組。③濃度為(6.25、12.5和25 nM)的siRNA轉(zhuǎn)染組。

1.2 Western Blot檢測(cè)p65蛋白 收集各組細(xì)胞，提取蛋白后，測(cè)定蛋白濃度。取p65蛋白20 μg上樣。采用常規(guī)wetern blot方法檢測(cè)各蛋白水平。anti-p65和anti-β-actin抗體濃度為1∶1000。最后進(jìn)行蛋白條帶顯色。

1.3 軟瓊脂集落形成試驗(yàn) 常規(guī)進(jìn)行軟瓊脂集落培養(yǎng)試驗(yàn)，試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行。

1.4 體外侵襲試驗(yàn) 采用Transwell方法檢測(cè)癌細(xì)胞侵襲能力，試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行，計(jì)算各組穿過濾膜的癌細(xì)胞數(shù)目。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞p65蛋白和NF-B活性的影響 結(jié)果顯示，65 siRNA轉(zhuǎn)染組p65蛋白水平和NF-κB活性明顯被抑制，且呈濃度依賴性(P＜0.05)。

圖1 胃癌細(xì)胞p65蛋白水平(48 h)

2.2 軟瓊脂集落形成試驗(yàn) 結(jié)果顯示，胃癌AGS細(xì)胞在體外半固體培養(yǎng)體系中可以自發(fā)地形成集落，而經(jīng)p65 siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞集落生長(zhǎng)呈劑量依賴性減少(P＜0.05)。見圖2。

圖2 p65 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌細(xì)胞錨著不依賴性增殖的影響

2.3 p65 siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲的影響 結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和脂質(zhì)體對(duì)照組比較，siRNA組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯下降，且與濃度相關(guān)(P＜0.05)。

圖3 p65 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲的影響

3 討論

本研究針對(duì)p65基因特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成siRNA，轉(zhuǎn)染了胃癌AGS細(xì)胞，采用Western Blot檢測(cè)了胃癌細(xì)胞p65蛋白水平，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組p65蛋白水平明顯受到抑制，且呈濃度依賴性。說明采用siRNA下調(diào)p65蛋白水平可抑制胃癌細(xì)胞NF-κB活性。也說明該siRNA可作為研究p65在胃癌侵襲作用中的有力工具。

腫瘤細(xì)胞可以錨著不依賴性生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞在軟瓊脂形成集落的多少可反映腫瘤細(xì)胞錨著依賴性的特性，且與其惡性程度呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度的p65 siRNA轉(zhuǎn)染處理后，癌細(xì)胞軟瓊脂形成集落數(shù)明顯減少，且呈劑量依賴性。Boyden小室模型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染處理后的胃癌細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少，且呈濃度依賴性。說明，敲除p65基因表達(dá)可在一定程度上抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。

綜上所述，采用RNAi技術(shù)敲除NF-B重壓亞單位p65表達(dá)，可抑制胃癌細(xì)胞增殖和惡性侵襲能力。

［1］ Ghosh S，May MJ，Kopp EB.NF-kappa B and Rel proteins:evolutionarily conserved mediators of immune responses．Annu Rev Immunol，1998，16:225-260．

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Inhibition of RNA interference against p65 subunit of the nuclear factor-κB on invasion of gastric cancer cell

ZHU Xiang，ZHU Ling，F(xiàn)AN Yu.Cancer Institute，Affiliated People's Hospital of Jiangsu University，Zhen-jiang 212002，China

ObjectiveTo study the effects of siRNA against the p65 subunit of nuclear factor-B(NFB)on invasion and anchorage-independent growth of gastric cancer cell line AGS.MethodsGastric cancer cell line AGS were transfected with different dose of p65 siRNA by use of oligofecamine.The expression of p65 protein and NF-B activity were detected by western blot.The anchorage-independent growth of cancer cells were determined by colony formation in soft agar.The invasion ability of gastric cancer cells were evaluated using Transwell.ResultsThe expression of p65 protein of tranfected cell inhibited significantly in a dose-dependent manner.Compared with control group，both colony formation in soft agar and cells traversed membrane of transfected cells reduced significantly in a dose-dependent manner，rescpectively.ConclusionThese data here indicated knock-downing p65 expression might inhibit invasion ability of gastric cancer cell．

Gastric carcinoma;Nuclear factor-B;p65;Invasion

鎮(zhèn)江市科技計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):SH2009014)

212002鎮(zhèn)江，江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院腫瘤研究所

范鈺