劉淑敏，王 娟，黃惠華*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510641)

影響綠茶浸提液與膽酸鹽結(jié)合的因素研究

劉淑敏，王 娟，黃惠華*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510641)

在體外模擬人體消化環(huán)境，通過測定在不同pH值、離子強度、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和尿素濃度條件下，綠茶浸提液在體外對?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉的結(jié)合能力，比較這些因素對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響。結(jié)果表明，pH值、尿素濃度對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽有顯著性影響(P≤0.05)，離子強度對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽影響不顯著(P≥0.05)。

綠茶浸提液；膽酸鹽；結(jié)合；影響因素

近年來，冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病成為威脅全人類健康的嚴(yán)重疾病之一，而高膽固醇是冠心病的主要誘因，保持膽固醇水平正常對于降低冠心病發(fā)生率具有重要意義。膽酸鹽是指來自人體和動物膽汁具有甾核結(jié)構(gòu)的一類兩性大分子，是人體合成膽固醇的前體物質(zhì)[1-2]。國內(nèi)外大量體外實驗和流行病學(xué)調(diào)查顯示，茶葉具有降血脂功能[3-7]。關(guān)于茶葉降血脂機理，目前尚無明確定論。有學(xué)者認(rèn)為，飲茶后，茶中的功能性成分在腸道內(nèi)能與膽酸鹽結(jié)合，影響脂類消化吸收，同時介入肝腸循環(huán)，使膽酸鹽排出體外，以促使肝臟中膽固醇不斷轉(zhuǎn)化為膽酸鹽，達到降血脂目的[8-11]。但是由于茶葉是多種物質(zhì)的復(fù)合體，與膽酸鹽作用方式多樣，對膽酸鹽結(jié)合能力影響因素較多。本實驗通過在體外模擬人體消化環(huán)境的實驗，研究不同因素對綠茶浸提液與膽酸鹽結(jié)合能力的影響，旨在探討影響茶葉與膽酸鹽結(jié)合的主要相互作用力，從機理方面探討茶中功能性成分與其結(jié)合膽酸鹽能力及其降血脂的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

綠茶，產(chǎn)地廣西、福建、云南。

?；悄懰徕c(STC)、甘氨膽酸鈉(SGC)、膽酸鈉(SC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 日本TCI公司；胰酶(蛋白酶4080U/g、脂肪酶33600U/g、淀粉酶91000U/g) 四川貝奧生物制藥有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

UV-1800紫外-可見分光光度計 日本島津公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱 深圳國華儀器廠；TDL-40B型臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 綠茶浸提液的制備

稱取20g綠茶，加入240mL蒸餾水，于80～85℃浸提60min，100目過濾，定容至250mL。

1.2.2 膽酸鹽含量的比色測定

分別取樣液(或不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液)2.5mL于具塞試管中，加入7.5mL 60%的硫酸，于70℃水浴20min，取出冰浴5min，于387nm波長處測定吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣液中膽酸鹽的濃度[12-13]。

1.2.3 人體胃腸道環(huán)境模擬

胃環(huán)境模擬：取一定量樣品，加入1mL 0.01mol/L的鹽酸溶液，在37℃恒溫振蕩消化1h。

腸環(huán)境模擬：以0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)胃環(huán)境模擬后樣品液pH值為6.3，隨后加入4mL 10mg/mL胰酶，(胰酶以pH6.3的0.1mol/L磷酸緩沖液配制)，在37℃恒溫振蕩消化1h。

1.2.4 茶多酚含量測定

采用GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》中方法測定。

1.2.5 影響綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的因素研究

1.2.5.1 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響

經(jīng)預(yù)實驗優(yōu)化確定膽酸鹽濃度為0.3mmol/L。分別稱取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g PVP，加入24mL綠茶浸提液，37℃恒溫振蕩30min， 5000r/min離心10min。分別取1mL上清液，經(jīng)胃腸模擬環(huán)境處理后加入4mL 膽酸鹽溶液(SC、STC、SGC濃度均為0.3mmol/L，用pH6.3、0.1mol/L磷酸緩沖液配制)，恒溫振蕩1h，4000r/min離心20min。測定上清液中的膽酸鹽含量[14]。

1.2.5.2 pH值對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響

取10mL綠茶浸提液于100mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH值為6.24，隨后加入40mL 10mg/mL胰酶，恒溫振蕩消化1h。將上述經(jīng)胃腸模擬環(huán)境處理的綠茶浸提液平均分成5份，分別調(diào)節(jié)其pH值為4.92、5.29、6.24、7.38、8.04，最后以相應(yīng)的磷酸緩沖溶液定容。取6mL經(jīng)調(diào)節(jié)pH值后的處理液，每個樣品中加入4mL膽酸鹽溶液(SC、STC、SGC濃度均為0.3mmol/L，分別以pH值為4.92、5.29、6.24、7.38、8.04的0.1mol/L磷酸緩沖液配制)，振蕩，離心。測定上清液中的膽酸鹽含量。

1.2.5.3 離子強度對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響

取1mL綠茶浸提液，經(jīng)胃腸模擬環(huán)境處理后吸取6mL，每個樣品中加入4mL膽酸鹽(SC、STC、SGC的濃度設(shè)定為0.3、0.6、1mmol/L，分別以pH6.3，濃度為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mmol/L的不同離子強度的磷酸緩沖液配制)，振蕩，離心。測定上清液中的膽酸鹽含量。

1.2.5.4 尿素對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響

將經(jīng)胃腸模擬環(huán)境處理的綠茶浸提液平均分成兩份，其中一份加入一定量尿素(1.5mmol/L)。取6mL上述試液，每個樣品中加入4mL膽酸鹽溶液(SC、STC、SGC濃度設(shè)定為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mmol/L，分別以pH6.3的0.1mol/L磷酸緩沖液配制)，恒溫振蕩，離心。對照為取6mL未加入尿素試液，其余操作相同。測定上清液中的膽酸鹽含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVP對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響

PVP可定量吸附茶多酚，其用量越大，茶多酚去除率越大。其吸附機理為：茶多酚分子中的活性氫基團可與PVP形成氫鍵而導(dǎo)致大分子的形成，由于PVP不溶于水，茶多酚分子就通過氫鍵不斷沉積到PVP上而被除去。用PVP處理綠茶浸提液，可得到不同茶多酚含量的綠茶浸提液。在PVP用量分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g時，茶多酚含量依次為26.95%、23.46%、16.2%、9.31%、4.75%、4.6%。經(jīng)不等量PVP處理后的綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的能力均存在顯著性差異(P≤0.05)，PVP用量為0g時最大，PVP用量為1g時最??；PVP處理后綠茶浸提液中茶多酚含量與其結(jié)合膽酸鹽的關(guān)系見圖1。

圖1 PVP對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響Fig.1 Effect of PVP on the adsorption of green tea extract to bile salts

如圖1所示，綠茶浸提液中所含茶多酚含量與其結(jié)合STC、SGC、SC的能力呈顯著性正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.976、0.984、0.981。表明茶多酚與綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽能力有關(guān)，綠茶浸提液中茶多酚含量越高，其結(jié)合膽酸鹽的能力越強，茶多酚會影響膽酸鹽的體內(nèi)代謝，從而起到降血脂作用。

2.2 pH值對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響

如圖2所示，綠茶浸提液在pH值為7.38、8.04時對膽酸鹽的結(jié)合能力顯著(P≤0.05)強于pH值為4.92時，而pH值為4.92時綠茶浸提液對膽酸鹽的結(jié)合能力顯著強于pH值為6.24時?？赡茉蚴莗H值會改變綠茶浸提液中功能性成分的水溶性，影響膽酸鹽微團的溶解性和陰離子化程度，從而影響膽酸鹽結(jié)合部位的暴露。因為STC、SGC、SC的pKa分別為3.33、6.2、4.98[15]，綠茶浸提液的pKa接近6.5，在pH6.24時，3種膽酸鹽微團溶解性較強，微團陰離子化程度較高，結(jié)合位點較多[16]，但弱酸性的綠茶浸提液在此介質(zhì)中的陽離子化程度較低，所以綠茶浸提液中功能性成分較難以離子鍵形式與吸附質(zhì)發(fā)生作用。在pH7.38時，既能保持膽酸鹽微團具有較高的陰離子程度，結(jié)合位點多，同時又可以使綠茶浸提液中功能性成分水溶性增強，生成較多的陽離子，使綠茶浸提液對膽酸鹽表現(xiàn)出最大吸附能力。pH值變化對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽能力的影響，說明綠茶浸提液與膽酸鹽的結(jié)合作用與綠茶浸提液中陽離子與膽酸鹽微團陰離子之間的靜電離子相互作用有關(guān)。

圖2 不同pH值對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響Fig.2 Effect of medium pH on the adsorption of green tea extract to bile salts

2.3 離子強度對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響

圖3 不同磷酸鹽離子強度對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響Fig.3 Effect of ionic strength on the adsorption of green tea extract to bile salts

如圖3所示，在不同離子強度的緩沖溶液中綠茶浸提液對3種膽酸鹽的結(jié)合量不存在顯著性差異(P≥0.05)，表明離子強度對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽不存在顯著性影響，疏水作用對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽無顯著貢獻。

2.4 尿素對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響

圖4 尿素對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的影響Fig.4 Effect of urea concentration on the adsorption of green tea extract to bile salts

為了考察氫鍵作用對吸附過程的影響，在有尿素存在下進行吸附實驗。尿素能夠形成氫鍵，并且優(yōu)先在自身與水之間形成氫鍵，影響膽酸鹽微團的穩(wěn)定性，促使膽酸鹽的活性基團暴露，從而有利于綠茶浸提液中功能性成分與膽酸鹽之間形成氫鍵。尿素存在的情況下綠茶浸提液對3種膽酸鹽的結(jié)合作用結(jié)果如圖4所示。在膽酸鹽初始濃度較低時，尿素對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽不存在顯著性影響，而在膽酸鹽初始濃度較高(SC濃度高于0.3mmol/L、STC濃度高于0.7mmol/L、SGC濃度高于0.5mmol/L)時，尿素對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽存在顯著性影響(P≤0.05)。由此可以推斷氫鍵在3種膽酸鹽吸附到綠茶浸提液表面的過程中起著一定的作用，可能是由于膽酸鹽中的羥基和茶多酚的酚羥基、咖啡堿的氨基形成氫鍵。

3 結(jié) 論

綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽能力與茶多酚含量呈顯著性相關(guān)關(guān)系，表明綠茶多酚是綠茶浸提液中結(jié)合膽酸鹽的功能成分，這是綠茶具有降血脂功能的機理之一。綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽能力與pH值及尿素顯著相關(guān)，表明靜電作用力和氫鍵作用均是綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽的主要相互作用力。綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽能力與離子強度變化差異不顯著，表明疏水作用力對綠茶浸提液結(jié)合膽酸鹽無顯著貢獻，不是主要作用力。

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Factors Influencing the Binding between Green Tea Extract and Bile Salt

LIU Shu-min，WANG Juan，HUANG Hui-hua*
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China)

Through determining the binding capacity of green tea extract to sodium taurocholate, glycocholate and sodium cholate under polyvinylpyrrolidone (PVP), medium pH, ionic strength and ureain vitro, the adsorption behavior of green tea extract to bile salts were compared. The results showed that medium pH and urea concentration had significant effects on binding of green tea extract to bile salts(P≤0.05), but the effect of ionic strength was not obvious(P≥0.05).

green tea extract；bile salts；binding；impact factor

TS201.7

A

1002-6630(2012)05-0029-04

2011-03-02

廣東省科技計劃項目(2010B020312005)；廣州市科技計劃項目(2010Z1-E221)

劉淑敏(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：liushuminlsm@163.com

*通信作者：黃惠華(1959—)，男，教授，博士，研究方向為食品科學(xué)及農(nóng)產(chǎn)品加工新技術(shù)。E-mail：fehuang@scut.edu.cn