范郁冰，肖 榮，李宗軍*

(國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心功能食品分中心，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

乳酸菌S-層蛋白及其黏附性相關(guān)研究技術(shù)

范郁冰，肖 榮，李宗軍*

(國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心功能食品分中心，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

乳酸菌為人體的重要生理性細(xì)菌，在維持人體腸道生態(tài)環(huán)境、提高機(jī)體免疫力等方面起到重要的作用。然而，乳酸菌發(fā)揮這些生理功能的重要前提是黏附到腸細(xì)胞的表面。隨著研究的深入，越來(lái)越多的研究表明乳酸菌S-層蛋白對(duì)宿主細(xì)胞具有黏附性，如羅伊氏乳酸菌S-層蛋白可與黏蛋白及人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29進(jìn)行黏附。在研究乳酸菌S-層蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的黏附時(shí)，人們采用了不同的方法。一些常用的基本方法有SDS-PAGE、層析純化技術(shù)、顯微鏡觀察技術(shù)等。隨著新技術(shù)的應(yīng)用，表面等離子共振技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)等也用于研究S-層蛋白的黏附性。本文將著重介紹S-層蛋白及S-層蛋白黏附性研究的相關(guān)技術(shù)。

乳酸菌；S-層蛋白；黏附性；提??；純化

乳酸桿菌是人及動(dòng)物腸道內(nèi)最重要的生理性細(xì)菌之一[1]，它不僅對(duì)人體腸道有益生的作用，同時(shí)也可以預(yù)防和治療腸道疾病[2]。進(jìn)入腸道的乳酸菌通過(guò)黏附定殖于腸黏膜表面以保護(hù)腸黏膜細(xì)胞免受各種病原微生物的損傷，所以乳酸菌在腸道內(nèi)的黏附、定殖是其發(fā)揮生理作用的前提和基礎(chǔ)。乳酸桿菌和宿主腸上皮細(xì)胞的黏附與乳酸菌體表面成分作用有關(guān)，如脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)、細(xì)胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)和細(xì)胞表面蛋白(surface layer protein，SLP)等，其中細(xì)胞表面蛋白起著重要的作用[3]。

研究乳酸菌表層蛋白的黏附性對(duì)于了解乳酸菌黏附腸細(xì)胞的機(jī)制有著關(guān)鍵的作用，本文對(duì)已應(yīng)用到乳酸菌表層蛋白黏附性研究的各種技術(shù)進(jìn)行闡述，以便為以后的研究提供更好的基礎(chǔ)。

1 乳酸菌S-層蛋白

1.1 乳酸菌S-層蛋白的特點(diǎn)

細(xì)菌表面性質(zhì)和結(jié)構(gòu)在細(xì)菌對(duì)宿主的黏附中起著重要的作用[4]。過(guò)去30多年的研究發(fā)現(xiàn)，在古生菌和細(xì)菌中最常見(jiàn)的一種表面結(jié)構(gòu)是由單分子蛋白質(zhì)亞單位組成的晶狀體結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為S-層蛋白(圖1)[5]。在多數(shù)細(xì)菌中，S-層蛋白與胞外基質(zhì)(例如纖維蛋白、纖層蛋白或其他的膠原蛋白)均具有黏附作用[6]。S-層蛋白晶體有斜形、正方形和六邊形。根據(jù)不同的晶格類(lèi)型，S-層蛋白可由1、2、4、5或6個(gè)蛋白質(zhì)亞基組成[7]。每個(gè)亞基中心距離為2.5～35nm。相對(duì)于表面而言，S-層蛋白的里面粗糙一些。S-層蛋白為網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)，其覆蓋面積可達(dá)總面積的70%。

在嗜酸乳桿菌、布氏乳桿菌、瑞士乳桿菌、保加利亞乳桿菌及短乳桿菌中均發(fā)現(xiàn)S-層蛋白[8]。這些種屬中的S-層蛋白具有相同的特性，分子質(zhì)量在25～71kD之間[9]，等電點(diǎn)在9.35～10.04之間。盡管在許多革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了S-層蛋白的糖基化結(jié)構(gòu)[10]，但是在大多數(shù)乳酸菌中S-層蛋白是非糖基化的，目前僅在布氏乳桿菌中發(fā)現(xiàn)有糖基化結(jié)構(gòu)[11]。許多乳酸菌含有1～2個(gè)編碼S-層蛋白的基因。由S-層蛋白的氨基酸分析可知，S-層蛋白含有較高的疏水性和酸性氨基酸。其中以賴(lài)氨酸為主，含有少量的精氨酸、蛋氨酸和組氨酸，在極少的S-層蛋白中發(fā)現(xiàn)含有半胱氨酸。到目前為止，所有已鑒定的乳酸桿菌表層蛋白都具有由 25～30 個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號(hào)肽，這些信號(hào)肽的長(zhǎng)度可以通過(guò) von Heijne[12]所提供的方法進(jìn)行預(yù)測(cè)。

圖1 電鏡下細(xì)菌表面S-層蛋白冰凍刻蝕照片[9]Fig.1 Electronic micrograph of bacterial surface S-layer proteins[9]

S-層蛋白具有一系列的功能，其基本功能有：維持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；力的穩(wěn)定性；熱穩(wěn)定性；滲透壓穩(wěn)定性。亞功能：包裹細(xì)胞；提供周質(zhì)空間；形成網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)與膜外蛋白相連；保護(hù)細(xì)胞免受外界環(huán)境因子的影響；防止微粒的進(jìn)入；免疫功能；與外環(huán)境相互作用；離子交換、連接金屬及生物礦物質(zhì)；表面黏附；毒力因子；噬菌體受體。盡管對(duì)于S-層蛋白的結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成、組裝以及基因等方面已經(jīng)具有一定的了解，但是在對(duì)于S-層蛋白的特殊功能上的認(rèn)識(shí)還不是很透徹。

1.2 乳酸菌S-層蛋白的黏附性

雖然對(duì)乳酸菌S-層蛋白的功能還不是很了解，但是隨著研究的深入，越來(lái)越多的研究表明乳酸菌S-層蛋白對(duì)宿主細(xì)胞具有黏附性。一些乳酸菌的S-層蛋白已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有黏附性，如羅伊氏乳酸菌S-層蛋白可與黏蛋白及人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29進(jìn)行黏附，短乳桿菌ATCC 8287 S-層蛋白與細(xì)胞外基質(zhì)纖維連接蛋白具有較高的黏附性[13]，而瑞士乳桿菌的S-層蛋白與腸細(xì)胞的黏附可以有效抑制大腸桿菌對(duì)腸細(xì)胞的黏附。

2 黏附性相關(guān)研究技術(shù)

人們采用了不同的研究方法對(duì)乳酸菌S-層蛋白的黏附性進(jìn)行研究，如免疫印記法、表面等離子共振法、熒光法等。下面將介紹幾種在研究S-層蛋白的黏附性時(shí)所用到的技術(shù)方法。

2.1 S-層蛋白提取分離純化技術(shù)

2.1.1 S-層蛋白的提取技術(shù)

人們對(duì)S層蛋白的提取最早是在1979年，Masuda等[15]用高濃度的尿素將S-層蛋白從短乳桿菌中提取出來(lái)。在1980年，Masuda等[16]又采用了高濃度的鹽酸胍提取短乳桿菌S-層蛋白。在2004年，Garrote等[17]利用高濃度的氯化鋰來(lái)提取開(kāi)菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)中的S-層蛋白。

大多數(shù)S-層蛋白可以通過(guò)利用高濃度的溶劑來(lái)破壞其氫鍵已達(dá)到分離的目的[6]。常用的溶劑有鹽酸胍和氯化鋰。一般的分離步驟為：將乳酸菌于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，離心收集菌體；PBS沖洗2～3次，加入高濃度提取劑，靜置反應(yīng)一段時(shí)間；高轉(zhuǎn)速離心收集上清液；低溫透析過(guò)夜便可得到粗的S-層蛋白提取物。對(duì)于提取不同菌株中的S-層蛋白，可以采用不同的溶劑處理以達(dá)到更好的效果。

2.1.2 S-層蛋白的SDS-PAGE電泳分離技術(shù)

由于采用LiCl或鹽酸胍等溶劑從細(xì)菌表面提取出的S-層蛋白中會(huì)含有許多雜質(zhì)蛋白，因此，還需要采用進(jìn)一步的方法對(duì)其進(jìn)行純化。常用的方法為聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。

將初步分離得到的S-層蛋白懸浮于緩沖液中，煮沸5～10min后加入染色劑即可用于進(jìn)行SDS-PAGE。在進(jìn)行S-層蛋白的純化時(shí)，常用的凝膠的濃度為10%左右。圖2為利用SDS-PAGE分離純化得到的S-層蛋白，其分子質(zhì)量為46kD[18]。

圖2 SDS-PAGE分離得到的S-層蛋白條帶[18]Fig.2 SDS-PAGE analysis of selected S-layer proteins[18]

2.1.3 S-層蛋白的純化技術(shù)

對(duì)S-層蛋白進(jìn)行研究時(shí)，可能需要進(jìn)一步的獲得純的S-層蛋白，常采用的方法是層析純化的方法。層析純化包括凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、親和層析、疏水作用層析、聚焦層析等。

1993年，Boot等[19]采用了陽(yáng)離子交換層析純化S-層蛋白。實(shí)驗(yàn)將S-層蛋白粗提取物通過(guò)陽(yáng)離子交換層析柱，用不同梯度濃度的緩沖液的沖洗，從而將S-層蛋白與雜質(zhì)蛋白分離，得到純度較高的S-層蛋白。除此之外，還可以利用S-層蛋白的其他性質(zhì)來(lái)選擇不同的層析方法，如已知S-層蛋白的分子質(zhì)量為40kD左右，則可以采用分辨率在其之間的凝膠來(lái)進(jìn)行純化。

目前，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)蛋白質(zhì)的純化還可以采用高效液相層析。與傳統(tǒng)的層析方法向比，高效液相層析具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：介質(zhì)顆粒的變小，具有更高的分辨率；流速的提高使HPLC提供更快的分離速度；易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

2.2 黏附性顯微鏡觀察研究技術(shù)

2.2.1 原子力顯微鏡觀察技術(shù)

2005年，Andrea Azcarate-peril等[20]利用原子力顯微鏡對(duì)S-層蛋白進(jìn)行了研究。原子力顯微鏡是一種利用原子、分子間的相互作用力來(lái)觀察物體表面微觀形貌的新型實(shí)驗(yàn)技術(shù)。與普通的顯微鏡相比，原子力顯微鏡具有一定的優(yōu)點(diǎn)：可以構(gòu)建三維立體的結(jié)構(gòu)，可以以力的形式直接觀察S-層蛋白與基質(zhì)間黏附力的大小[21]，樣品的前處理簡(jiǎn)單等。

2.2.2 熒光顯微鏡觀察技術(shù)

近幾年，熒光標(biāo)記的方法在研究乳酸菌及其S-層蛋白的黏附性中有了一定的應(yīng)用。有的采用異硫氰酸熒光素標(biāo)記乳酸菌S-層蛋白[18]，在熒光顯微鏡下檢測(cè)其對(duì)腸細(xì)胞的黏附情況；也有的采用細(xì)胞熒光素標(biāo)記細(xì)胞，然后觀測(cè)乳酸菌對(duì)其黏附的情況。

2007年，Kathene等[22]運(yùn)用熒光標(biāo)記的方法檢測(cè)到瑞士乳桿菌的S-層蛋白可以降低大腸桿菌對(duì)腸細(xì)胞的黏附，從而表明瑞士乳桿菌的S-層蛋白可以與腸細(xì)胞黏附。如圖3所示，在添加了S-層蛋白之后，大腸桿菌與腸細(xì)胞的黏附降低了。

圖3 熒光顯微鏡觀察S-層蛋白的黏附性[22]Fig.3 Adhesion of S-layer protein under fluorescence microscope[22]

2.3 基于免疫學(xué)的黏附性研究技術(shù)

在測(cè)定S-層蛋白黏附性實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用的最多的免疫學(xué)技術(shù)為Western Blot雜交技術(shù)。Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳將分離的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上以作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性蛋白成分。

2005年，王斌等[23]就采用了Western Blot技術(shù)研究羅伊氏乳桿菌S-層蛋白對(duì)黏蛋白和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29的黏附性。在2008年，劉瓊等[24]利用Western Blot雜交技術(shù)對(duì)S-層蛋白表面展示載體進(jìn)行檢測(cè)。

采用Western Blot技術(shù)時(shí)，是以S-層蛋白為抗原，以制備的標(biāo)記了的黏蛋白和細(xì)胞為抗體，以DAB為顯色劑。Western Blot雜交技術(shù)主要步驟為將蛋白SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，分別用已標(biāo)記的黏蛋白和HT-9細(xì)胞進(jìn)行雜交反應(yīng)，沖洗去除未雜交的黏蛋白或HT-9細(xì)胞，DAB顯色即可觀察到S-層蛋白是否發(fā)生了黏附反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在羅伊氏乳酸菌中，分子質(zhì)量為29kD和14kD的S-層蛋白與黏蛋白和HT-9細(xì)胞均有黏附性。

2.4 用于黏附性的表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)研究技術(shù)

表面等離子共振(SPR)近年來(lái)迅速發(fā)展為用于分析生物分子相互作用的一項(xiàng)技術(shù)[25]，其利用生物大分子間(抗體與抗原、酶與底物等)的特異性結(jié)合進(jìn)行分子識(shí)別，并通過(guò)光激勵(lì)→分子識(shí)別→光輸出→電輸出的途徑，完成分子相互作用的信息傳遞與檢測(cè)[26]。

de Leeuw等[27]利用了SPR技術(shù)對(duì)S-層蛋白與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)黏附性進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)將經(jīng)過(guò)LiCl提取透析后的純S-層蛋白于20000×g離心20min后，利用羥基琥鉑酰二胺將其共價(jià)偶聯(lián)到葡聚糖羧化物上，使S-層蛋白固定至載體表面。而未連接的非共價(jià)羥基琥鉑酰二胺酯則利用乙醇胺填滿。利用表面活性劑(10mmol/L HEPES、150mmol/L NaCl、3mmol/L EDTA、0.5g/mL表面活性劑P20，pH7.4)于25℃活化。將待測(cè)的ECM物質(zhì)(纖連蛋白、層黏連蛋白和膠原蛋白)注入至SPR中，控制流速20μL/min，BlAevaluation 4.1軟件分析。S-層蛋白與不同的ECM的黏附如表1所示。實(shí)驗(yàn)表明，S-層蛋白與黏蛋白和層黏連蛋白具有較高的黏附性，而與膠原蛋白和纖維蛋白的黏附性很低。

運(yùn)用SPR技術(shù)，可以直接的觀測(cè)到S-層蛋白與胞外基質(zhì)黏附性的情況，且采用這種技術(shù)，對(duì)樣品的需求量小，樣品無(wú)需標(biāo)記、特異性強(qiáng)、靈敏度高[25]。但是，目前這種方法運(yùn)用的并不是很普遍，因此，運(yùn)用此方法可對(duì)人們研究S-層蛋白提供新的途徑。

表1 S-層蛋白與胞外基質(zhì)黏附情況Table 1 Binding characteristics of S-layer proteins to extracellular matrix

3 結(jié) 語(yǔ)

乳酸菌作為腸道的生理性細(xì)菌，在定殖、黏附于腸道上后對(duì)維持腸道的穩(wěn)定性具有重要的作用[28]。S-層蛋白作為乳酸菌的黏附因子之一，已經(jīng)越來(lái)越受到人們的關(guān)注。雖然目前對(duì)于乳酸菌S-層蛋白黏附性的研究還處于初步階段，但是隨著新的方法的不斷引入，人們對(duì)S-層蛋白及其黏附性也有了一定的認(rèn)知。通過(guò)本文的闡述，人們已經(jīng)確定了S-層蛋白的黏附性并獲知了其可以與腸細(xì)胞黏蛋白、層黏連蛋白發(fā)生較好的黏附。然而，S-層蛋白的黏附機(jī)理仍未揭開(kāi)。想要了解這一黏附機(jī)理，還需從不同的角度運(yùn)用各種方法來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)室也將從分子學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的角度對(duì)乳酸菌S-層蛋白的黏附性進(jìn)行更加深入的研究。

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LactobacillusSurface Layer Proteins and Research Techniques for Their Adhesion: A Review

FAN Yu-bing，XIAO Rong，LI Zong-jun*
(Functional Foods Branch, National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, Changsha 410128, China)

Lactobacillus, an important kind of physiological bacteria in the human body, plays an important role in maintaining human intestinal ecosystem environment and intestinal health. However, the most important premise forLactobacillusto execute its physiological functions is the adhesion on the surface of intestinal cells. More and more studies have showed that S-layer protein has the ability to adhere to intestinal cells. For example,Lactobacillus reuterican adhere to mucoprotein and HT-9 cells.Various methods such as SDS-PAGE, chromatographic purification, and microscopic observation have been successfully applied to study the adhesion ofLactobacillusto intestinal cells. The applications of surface plasma resonance and immunological techniques to study S-layer protein adhesion have gained extensive attention as a result of the development of new techniques.In this paper, recent research advances inLactobacillusS-layer proteins and their adhesion are reviewed.

Lactobacillus；S-layer protein；adhesion；extraction；purification

TS201.21

A

1002-6630(2012)01-0294-04

2011-01-22

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z347)

范郁冰(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。E-mail：fan_yubing@163.com

*通信作者：李宗軍(1968—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：lizongjun@yahoo.com.cn