彭雅莉，胡 飛*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

大麥芽極限糊精酶的分離純化及酶學(xué)特性分析

彭雅莉，胡 飛*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

將大麥芽提取的極限糊精酶粗酶液，利用硫酸銨沉淀、離子交換層析和凝膠過濾色譜等分離方法對極限糊精酶進(jìn)行逐步分離純化。結(jié)果表明：純化倍數(shù)為31.23，回收率為8.81%。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，圖譜顯示樣品具有較高的純度，分子質(zhì)量約為97kD。同時(shí)研究了純化前后極限糊精酶在不同作用環(huán)境下酶的活性變化，發(fā)現(xiàn)純化后樣品在溫度45℃和pH 5.5左右具有最大酶活性，與粗酶液中酶活性相比具有明顯差異。在體系中添加不同濃度的金屬離子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mg2+、Ca2+、Mn2+在濃度較低時(shí)，對酶活性具有激活作用，而濃度較高時(shí)，則具有抑制作用；整體上，K+對酶活性影響不大；Zn2+、Fe2+對酶活性具有抑制作用。

極限糊精酶；純化；酶特性

麥芽是啤酒釀造的重要原料，主要貯藏物質(zhì)是淀粉，其中包括20%～40%直鏈淀粉和60%～80%支鏈淀粉，兩者都為高分子物質(zhì)，必須由一系列酶作用形成小分子可發(fā)酵性糖才能被酵母利用[1-2]。麥芽中與淀粉降解密切相關(guān)的淀粉酶主要有α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶等[3-5]。α-淀粉酶可將淀粉分子鏈內(nèi)的α-1,4-葡萄糖苷鍵任意水解；β-淀粉酶的作用是從非還原性末端的第二個(gè)α-1,4-葡萄糖苷鍵開始降解淀粉分子。大麥芽極限糊精酶又稱植物普魯蘭酶，能夠?qū)Ｒ坏卮呋蒸斕m、支鏈淀粉和極限糊精α-1,6-糖苷鍵。3種酶協(xié)同作用方可將大麥芽中淀粉降解為各種小分子糖，由于α-淀粉酶和β-淀粉酶不能水解支鏈糊精，因此兩者協(xié)同作用雖可以加快淀粉的降解速度，并不能改變終產(chǎn)物的組成。而極限糊精酶具有高度的特異性，從而可以提高淀粉的糖化率[5-6]。

相比α-淀粉酶和β-淀粉酶，大麥芽極限糊精酶由于含量少、存在抑制蛋白[7]且檢測方法不完善，一直未受到人們的重視，而且學(xué)術(shù)界對它的作用存在一定的爭議。但近年來，作為麥芽中的一種淀粉酶，它的重要性越來越受到研究工作者的關(guān)注。現(xiàn)階段，國內(nèi)對極限糊精酶的相關(guān)研究主要集中于谷物籽粒發(fā)芽過程中極限糊精酶活性的變化[8-11]，關(guān)于極限糊精酶提取純化及特性的研究較少。因此，將大麥芽中極限糊精酶進(jìn)行分離并達(dá)到一定的純度，進(jìn)而對其特性進(jìn)行更深入的分析，既能豐富淀粉酶科學(xué)領(lǐng)域，又對食品釀造工業(yè)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥芽(Kendall) 廣州麥芽公司。

硫酸銨 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris) 天津市瑞金化學(xué)品有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽、考馬斯亮藍(lán)G-250 上海伯奧生物科技有限公司；DEAE-瓊脂糖凝膠FF(DEAE Fast Flow) 美國GE公司；葡聚糖凝膠G-100 上海浩宏生物科技有限公司；普魯蘭 愛爾蘭Megazyme公司；透析袋 (截留相對分子質(zhì)量14000) 美國光譜醫(yī)學(xué)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用有限公司；FD-1B-50冷凍干燥機(jī) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DYCZ-3 型電泳槽、DYY-4C型電泳儀 北京六一儀器廠；HID3紫外檢測儀 上海金鵬分析儀器有限公司；Purifer100純化儀 美國GE公司。

1.3 方法

1.3.1 極限糊精酶分離純化

1.3.1.1 麥芽極限糊精酶粗酶液的制備

對干燥后的大麥芽進(jìn)行粉碎，過孔徑35目篩，得到預(yù)處理麥芽粉。添加pH5.4的磷酸緩沖液(1:5.37，m/V)及適量22.3mmol/L還原劑(L-半胱氨酸鹽酸鹽)到麥芽粉中，振蕩均勻，37.5℃水浴17.5h，然后3000r/min離心10min，得到麥芽淀粉酶粗提液Ⅰ。

1.3.1.2 硫酸銨分級沉淀

取一定量的粗酶液Ⅰ，緩慢加入適量研磨后的硫酸銨粉末，4℃靜置過夜，3000r/min離心10min，沉淀用Tris-HCl緩沖液(20mmol/L，pH7.0)溶解后，用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[12]和普魯蘭法[13-14]分別測定上清液和沉淀溶解液中蛋白質(zhì)含量和酶活力。據(jù)此選取最佳硫酸銨飽和度，得到的分離液為粗酶液Ⅱ。

1.3.1.3 酶液Ⅱ的透析

通過透析處理粗酶液Ⅱ中存在的無機(jī)離子和有機(jī)小分子物質(zhì)。將粗酶液Ⅱ裝入預(yù)處理后的透析袋中，置于4℃冰箱中，用5倍體積以上的去離子水充分透析，數(shù)小時(shí)更換一次，直至用BaCl2檢測不到SO42－為止，冷凍干燥后備用。

1.3.1.4 離子交換層析(DEAE-瓊脂糖凝膠FF)

取100mL DEAE-瓊脂糖凝膠FF，用pH7.0的20mmol/L Tris-HCl緩沖液配成勻漿，脫氣后填于 1.6cm×60cm的玻璃柱中，床體積約為80mL。將透析處理后的粗酶液Ⅱ上樣 25mL，以0～0.5mol/L NaCl的緩沖液梯度洗脫，流速為4mL/min，檢測波長為280nm。收集蛋白活性部分，測定蛋白質(zhì)含量和極限糊精酶活力。收集液鹽析后進(jìn)行冷凍干燥。

1.3.1.5 凝膠過濾色譜(Sephadex G-100)

采用Sephadex G-100(1.6cm×40cm)柱層析分離提純極限糊精酶，柱體積約為60mL。將經(jīng)過離子交換層析的酶液上樣5mL，以 pH5.5的20mmol/L醋酸緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為3mL/min，每管收集2mL，檢測波長為280nm。收集蛋白質(zhì)部分，測定蛋白質(zhì)含量和極限糊精酶活力，收集液鹽析后進(jìn)行冷凍干燥。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測定

考馬斯亮藍(lán)G-250在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。在波長595nm處測定吸光度A595nm，其與蛋白質(zhì)含量成正比。

1.3.3 極限糊精酶活力的測定

采用普魯蘭法[13-14]，取酶液0.4mL，加入含0.5mg/mL牛血清白蛋白(BSA)的醋酸鈉緩沖液(0.2mol/L，pH5.5)0.1mL，40℃水浴預(yù)熱5min，加入底物溶液(0.5g普魯蘭溶于25mL，0.5mol/L KCl溶液)，反應(yīng)10min后于510nm波長處測定吸光度，計(jì)算酶活力。

式中：m1為還原糖質(zhì)量/mg；V1為酶液體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；V2為反應(yīng)液體積/mL；t為反應(yīng)時(shí)間/min；m2為麥芽粉質(zhì)量/mg。

其中還原糖質(zhì)量由DNS法測得。

1.3.4 SDS-PAGE分析

采用SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定樣品分子質(zhì)量和酶的純度。5%濃縮膠，12%分離膠。恒定電流作用4h后，用冷凝水冷卻電泳槽。用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色，脫色后，拍照。

1.3.5 極限糊精酶酶學(xué)特性

1.3.5.1 溫度對極限糊精酶活性的影響

取粗酶液Ⅰ或純化后的酶液0.4mL加入含0.5mg/mL BSA的醋酸鈉緩沖液(0.2mol/L，pH5.5)0.1mL，分別在35～70℃溫度梯度下水浴預(yù)熱5min，加入底物溶液(0.5g普魯蘭溶于25mL 0.5mol/L KCl溶液)，反應(yīng)10min后于510nm波長處測定吸光度。

1.3.5.2 pH值對極限糊精酶活性的影響

取粗酶液Ⅰ或純化后的酶液0.4mL加入含0.5mg/mL BSA的醋酸鈉緩沖液(0.2mol/L)0.1mL，緩沖液pH3.5～6.5，然后40℃水浴預(yù)熱5min，加入底物溶液(0.5g普魯蘭溶于25mL，0.5mol/L KCl溶液)，反應(yīng)10min后于510nm波長處測定吸光度。

1.3.5.3 不同金屬離子對極限糊精酶活性的影響

取純化后的酶液0.4mL加入含0.5mg/mL BSA 的醋酸鈉緩沖液(0.2mol/L pH5.5)0.1mL，其中緩沖液中加入不同金屬離子(0～14mmol/L)，40℃水浴預(yù)熱5min，加入底物溶液(0.5g普魯蘭溶于25mL，0.5mol/L KCl溶液)，反應(yīng)10min后于510nm波長處測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 極限糊精酶的分離純化

2.1.1 硫酸銨分級沉淀

將酶萃取液(設(shè)其相對酶活力為100%)經(jīng)硫酸銨鹽析后，分析其酶集中分布區(qū)，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)硫酸銨飽和度小于30%時(shí)，沉淀中相對酶活力較低，而上清液中相對酶活力較高，說明該飽和度以下，酶鹽析量較少。隨著硫酸銨飽和度的提高，沉淀中蛋白質(zhì)含量增加，沉淀中相對酶活力也隨之上升，表明由于鹽析作用較多的酶沉淀下來。當(dāng)飽和度達(dá)到80%后沉淀中相對酶活力基本不變。因此，選取飽和度為30%的硫酸銨去除雜蛋白，然后在上清液中補(bǔ)加硫酸銨至飽和度為80%，鹽析后得到粗酶液Ⅱ，進(jìn)行透析后冷凍干燥。

圖 1 極限糊精酶鹽析曲線Fig.1 Salting out curve of limit dextrinase

2.1.2 DEAE-瓊脂糖凝膠FF分離

冷凍干燥的樣品經(jīng)DEAE-瓊脂糖凝膠FF離子交換柱分離后主要得到3個(gè)蛋白質(zhì)吸收峰，波長為280nm處Purifer100純化儀檢測值如圖2所示。

圖2 離子交換層析波長280nm處檢測值Fig.2 Elution curve of proteins on DEAE Sepharose FF column

圖3 離子交換層析中極限糊精酶活力Fig.3 Elution curve of limit dextrinase on DEAE Sepharose FF column

在波長510nm處測定極限糊精酶活力，由圖3可以看出，第1個(gè)峰中含有少量極限糊精酶，主要原因是在洗脫時(shí)，由于上樣量稍多，一小部分目標(biāo)蛋白隨之洗出；同時(shí)由于提取過程采用水提法，粗提液中含有α-淀粉酶、β-淀粉酶等水溶性酶，故經(jīng)離子交換層析時(shí)有較多的雜蛋白洗出。第2個(gè)峰中極限糊精酶含量很少。第3個(gè)峰含有較高的極限糊精酶活力，將該部分進(jìn)行收集，測定其酶活力和蛋白質(zhì)含量，并進(jìn)行冷凍干燥。

2.1.3 凝膠過濾色譜純化

經(jīng)上述離子交換柱層析后，再經(jīng)凝膠過濾色譜柱按分子質(zhì)量大小進(jìn)一步分離，洗脫結(jié)果如圖4所示，主要得到兩個(gè)蛋白質(zhì)吸收峰，吸光度為HID3紫外檢測儀在波長280nm處檢測值。在波長510nm處測定極限糊精酶活力(圖5)發(fā)現(xiàn)：圖4第1個(gè)峰極限糊精酶活力較高，主要為極限糊精酶；而圖4第2個(gè)峰極限糊精酶活力較低，主要為一些小分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)。收集含有極限糊精酶部分的溶液，測定酶活力和蛋白質(zhì)含量。再次透析后進(jìn)行冷凍干燥，得到樣品。

圖4 凝膠過濾色譜在280nm檢測值Fig.4 Elution curve of proteins on Sephadex G-100 column

圖5 凝膠過濾色譜中極限糊精酶活力Fig.5 Elution curve of limit dextrinase on Sephadex G-100 column

2.1.4 純化結(jié)果分析

經(jīng)上述各步分離純化后得到的結(jié)果如表1所示，最終酶比活力為22.09mU/mg，回收率為8.81%，純化倍數(shù)為31.23，可以看出經(jīng)過多步分離純化后，得到了純度較高的極限糊精酶樣品。

表1 各步純化結(jié)果分析Table 1 A summary of purification of limit dextrinase

在強(qiáng)還原劑作用下，蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵將被還原，蛋白質(zhì)解聚為多肽鏈。在聚丙烯酰胺凝膠電泳中加入一定量的十二烷基硫酸鈉，使得形成的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物帶有大量的電荷，掩蓋了不同蛋白質(zhì)間電荷的差異，電泳時(shí)蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的遷移率主要取決于其分子質(zhì)量的大小，而其他因素對電泳的影響可以忽略，從而可將不同分子質(zhì)量的蛋白分離開來。將純化后樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖6?？梢钥闯黾兓髽O限糊精酶樣品主要有一條帶，因此可認(rèn)為所制備得到的樣品純度較高，同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量相比，該酶分子肽鏈的分子質(zhì)量約為97kD。

圖6 純化樣品SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified limit dextrinase

2.2 極限糊精酶的酶學(xué)特性

2.2.1 最適溫度

由圖7可見，極限糊精酶純品在45℃左右具有最大活性，而對比研究表明麥芽粗提液Ⅰ中極限糊精酶活力最適溫度為55℃，糖化過程中溫度達(dá)到60℃時(shí)仍具有一定的酶活力。最適溫度發(fā)生顯著變化的原因可能在于麥芽浸出物中的其他成分對極限糊精酶起到了一定的熱保護(hù)作用，使得純化后的極限糊精酶的最適溫度顯著降低。

圖7 溫度對極限糊精酶活性的影響Fig.7 Effect of temperature on the activity of limit dextrinase

2.2.2 最適pH值

圖8 pH值對極限糊精酶活性的影響Fig.8 Effect of pH on the activity of limit dextrinase

如圖8所示，純化后的極限糊精酶最適pH值為5.5，與粗提液Ⅰ中極限糊精酶相比有所增加。說明極限糊精酶作用環(huán)境的物質(zhì)組成不同，體現(xiàn)出不同的最適pH值要求。也有研究報(bào)道[15]在極限糊精酶粗提液中加入牛血清蛋白時(shí)，極限糊精酶最適pH值會提高到5.5～6.5。

2.2.3 金屬離子對酶活性的影響

在反應(yīng)體系中分別加入不同的金屬離子，以不加金屬離子的相對酶活力為100%，40℃條件下測定其相對酶活力。由圖9可知，Mg2+、C a2+、M n2+在濃度較低(8～10mmol/L以下)時(shí)，對酶活性有一定的激活作用，濃度較高時(shí)，則會抑制酶活性。 整體上，K+對酶活性影響不大，Zn2+、Fe2+對酶活性有抑制作用，特別是隨著濃度的增大，抑制作用顯著增強(qiáng)。

圖9 金屬離子濃度對酶活性的影響Fig.9 Effect of metal ions on the activity of limit dextrinas

3 結(jié) 論

3.1 大麥芽極限糊精酶的粗提液經(jīng)硫酸銨沉淀、離子交換層析和凝膠過濾色譜法純化后，酶比活力由粗酶液中的0.71mU/mg提高至純化后的22.09mU/mg，純化倍數(shù)達(dá)到了31.23倍，說明樣品經(jīng)多步分離純化后已具有較高的純度。同樣經(jīng)電泳證實(shí)，圖譜上顯示出單一譜帶，分子質(zhì)量約為97kD。極限糊精酶的回收率僅為8.81%，說明它在淀粉酶中的含量相對較少。

3.2 對純化后樣品的最適溫度和pH值進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其與粗酶液Ⅰ中酶特性具有一定差異，純化樣品在溫度45℃和pH5.5左右具有最大活性，而粗酶液Ⅰ在溫度55℃和pH5.0時(shí)具有最大酶活性。

3.3 通過添加不同濃度的金屬離子研究其對極限糊精酶酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)Mg2+、Ca2+、Mn2+在8～10mmol/L以下時(shí)，對酶活性有一定的激活作用，濃度較高時(shí)，則會抑制酶活性。整體上，K+對酶活性影響不大，Zn2+、Fe2+對酶有抑制作用，特別是隨著濃度的增大，抑制作用顯著增強(qiáng)。

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Purification and Enzymatic Characterization of Limit Dextrinase from Malted Barley

PENG Ya-li，HU Fei*
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

This study was carried out to separate and purify limit dextrinase from malted barley by (NH4)2SO4 salting out, DEAE Sepharose FF column chromatography and Sephadex G-100 column chromatography. A purification fold of 31.23 and a recovery of 8.81% were achieved. The SDS-PAGE pattern of the purified limit dextrinase revealed a single band of protein (97 kD). The effects of temperature and pH on limit dextrinase in both the crude extract and purified sample were studied. The results indicated that maximum activity of the purified limit dextrinase was observed under the conditions of 45 ℃ and pH 5.5 and showed an obvious difference as compared with the crude enzyme extract. Moreover, Mg2+, Ca2+and Mn2+increased the activity of the enzyme at low concentrations, whereas Zn2+and Fe2+inhibited the activity at high concentrations. K+did not exhibit any effects on the activity of the enzyme.

limit dextrinase；purification；enzymatic characterization

TS201.2

A

1002-6630(2012)01-0204-05

2011-05-25

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2007A020100001-12)

彭雅莉(1987—)，女，碩士研究生，主要從事谷物化學(xué)與工程研究。E-mail：ppyhoo@163.com

*通信作者：胡飛(1972—)，男，副教授，博士，主要從事糧食資源化學(xué)與技術(shù)研究。E-mail：g95216@163.com