郭守興 （云南省普洱市景谷縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 666400） 沈?qū)W文 （云南省紅河州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 蒙自） 肖嘯 （云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 昆明）

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口服PHA復(fù)合物對(duì)犬瘟熱疫苗免疫效果的影響

郭守興 （云南省普洱市景谷縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 666400） 沈?qū)W文 （云南省紅河州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 蒙自） 肖嘯*（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 昆明）

試驗(yàn)通過(guò)選擇12只健康幼犬，隨機(jī)分成對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組6只。試驗(yàn)當(dāng)天進(jìn)行免疫接種，試驗(yàn)組每只皮下注射1頭份犬瘟熱-犬細(xì)小二聯(lián)苗，同時(shí)口服PHA復(fù)合物0.1mg/kg，對(duì)照組每只皮下注射1頭份二聯(lián)苗。各組在接種前及接種后7、14d，分別采血用CDV-Ab金標(biāo)試紙條測(cè)定其抗體滴度，計(jì)算陽(yáng)轉(zhuǎn)率并進(jìn)行T檢驗(yàn)：接種后7d，對(duì)照組陽(yáng)轉(zhuǎn)率為33.3%，試驗(yàn)組陽(yáng)轉(zhuǎn)率為66.7%，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，陽(yáng)轉(zhuǎn)率提高約2倍；接種后14d，對(duì)照組抗體滴度平均水平為1:22.5，試驗(yàn)組抗體滴度的平均水平為1:45。對(duì)照組陽(yáng)轉(zhuǎn)率為66.7%，試驗(yàn)組陽(yáng)轉(zhuǎn)率為83.3%，試驗(yàn)組比對(duì)照組相提高了16.6%。T檢驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。試驗(yàn)組抗體離散度縮小，在1:64~1:128之間波動(dòng)。試驗(yàn)表明：PHA復(fù)合物可明顯提高幼犬對(duì)犬瘟熱疫苗的抗體應(yīng)答能力，是一種良好的犬瘟熱疫苗免疫增效劑。

PHA復(fù)合物 犬瘟熱疫苗 免疫效果

植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)是一種從紅蕓豆中提取的有絲分裂原，是由D-甘露糖、氨基葡糖醛酸衍生物所構(gòu)成的低聚糖輔基與蛋白質(zhì)復(fù)合物，PHA有促進(jìn)淋巴細(xì)胞有絲分裂、激活淋巴細(xì)胞的作用。是一種干擾素誘導(dǎo)劑，不僅可以刺激機(jī)體產(chǎn)生白介素-2和干擾素，還可以刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性抗體[1]。據(jù)美國(guó)《Science》雜志報(bào)道，機(jī)體免疫系統(tǒng)通過(guò)識(shí)別PHA而識(shí)別病毒，并產(chǎn)生相應(yīng)的抗體和其他免疫反應(yīng)，以從體內(nèi)清除病毒[2]。PHA與黃芪多糖等多種中草藥聯(lián)用具有增效作用，與部分抗生素聯(lián)用具有相加作用。植物血凝素作為天然的免疫細(xì)胞激活劑具有毒副作用小、安全范圍大、無(wú)種屬特異性、不易產(chǎn)生耐藥性、不易產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)、無(wú)殘留、生物利用率較高的特點(diǎn)[3]。

由于PHA強(qiáng)大的增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫力的作用以及強(qiáng)效的抗病毒作用，其作為一種新型的天然廣譜抗病毒藥物在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛。在獸藥中的應(yīng)用也日益廣泛。

PHA也具有多種免疫效應(yīng)：能刺激多種淋巴細(xì)胞分裂增殖，是多克隆激活劑；能促進(jìn)淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，如IFN-γ、IL-2等；同時(shí)PHA可促進(jìn)抗體形成，這些結(jié)果證明PHA具有強(qiáng)大的免疫增強(qiáng)作用[4]。

犬瘟熱(canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的急性、高度接觸傳染性、致死性傳染病，是當(dāng)前影響?zhàn)B犬業(yè)發(fā)展的最嚴(yán)重的第一大傳染病。幼犬出生8周左右，其血清中的抗體滴度大多已經(jīng)低于免疫保護(hù)所需要的水平，必須盡快接種犬瘟熱疫苗。接種犬瘟熱疫苗后一般需要2周才能達(dá)到免疫保護(hù)所需要的中和抗體水平。幼犬在出生8周左右最易感染犬瘟熱，為使幼犬接種犬瘟熱疫苗后盡快產(chǎn)生抗體并達(dá)到免疫保護(hù)所需要的抗體水平，以及縮短幼犬易感期，特進(jìn)行了此試驗(yàn)。

目前，有關(guān)口服PHA對(duì)犬瘟熱病毒免疫效果影響的研究鮮見報(bào)道，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)健康犬注射犬瘟熱-犬細(xì)小二聯(lián)苗，同時(shí)口服PHA復(fù)合物，測(cè)定犬免疫效果的變化，以研究PHA是否對(duì)犬瘟熱病毒免疫效果產(chǎn)生影響，以期為PHA在動(dòng)物方面的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 本次試驗(yàn)所用的12只健康犬均由康大媽流浪狗收容所提供，所有接種疫苗的犬均無(wú)過(guò)往疾病史，精神狀態(tài)良好，經(jīng)檢測(cè)抗體水平符合接種條件，不符合的均已被剔除。試驗(yàn)前、后均按正常方式飼養(yǎng)，環(huán)境、飼料不變。

1.1.2 試驗(yàn)藥物 PHA復(fù)合物(云南大理金明動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)20100101)、犬瘟熱-犬細(xì)小二聯(lián)苗(荷蘭英特威公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)A063A01)。

1.1.3 試驗(yàn)儀器及試劑 真空貯血管(5ml，無(wú)抗凝，江西格蘭斯醫(yī)療器械有限公司)；采血針(江西洪達(dá)醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司)；離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠)；CDV-Ab金標(biāo)試紙條(韓國(guó)安捷公司，內(nèi)有稀釋緩沖液1瓶，吸液塑料管1支)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組 將12只年齡、體重相近的健康犬隨機(jī)分成對(duì)照組和試驗(yàn)組2組，每組6只。試驗(yàn)組提前1周喂服PHA復(fù)合物0.1mg/kg體重，1次/d，連續(xù)給藥5d，1周后，試驗(yàn)組與對(duì)照組同時(shí)接種免疫，每只試驗(yàn)犬皮下注射1頭份英特威二聯(lián)苗，疫苗接種后試驗(yàn)組繼續(xù)投藥，方法劑量與前次相同，連用5d，1周后，再按之前的方法再次給藥5d。整個(gè)過(guò)程，對(duì)照組均不做給藥處理。各試驗(yàn)犬均按正常方式管理、飼喂。

1.2.2 血樣的采集和處理 試驗(yàn)為期3周，各組在免疫接種前及接種后7、14d，分別前肢靜脈采血3ml，將所采血樣分組編號(hào)，用離心機(jī)4000轉(zhuǎn)離心5min，分離出血清。

1.2.3 抗體滴度的測(cè)定 血清處理后用CDV-Ab金標(biāo)試紙條測(cè)定其抗體滴度：用包裝內(nèi)的塑料吸管吸取適量血清，滴入稀釋緩沖液中，混合均勻，吸取混合液，在試紙條的加樣孔里滴加3至4滴，室溫靜置20min，比較T線與C1、C2線的線條寬度與顏色深淺(注釋：稀釋緩沖液中含有少量的疊氮鈉作為防腐劑，該藥物有毒性，必須小心處理并且避免皮膚接觸)。

1.2.4 試驗(yàn)結(jié)果判定 CDV-Ab金標(biāo)試紙條判定：①C1線為低抗體水平測(cè)量對(duì)照線，抗體水平相當(dāng)于1:16，C2為高抗體水平測(cè)量對(duì)照線，相當(dāng)于1:128的抗體水平。②如果T線的線條寬度和顏色深淺弱于C1線，那血清的抗體水平判定就以C1為準(zhǔn)，具體方法是：如果T線不出現(xiàn)，則該血清抗體水平為0，如果T線線條寬度和顏色深淺是C1線的1/4，則抗體水平為1:2，是C1線的1/3則抗體水平為1:4，是C1線的1/2時(shí)，抗體水平為1:8，如果與C1相近則為1:16。③如果T線的線條寬度和顏色深淺強(qiáng)于C1線而弱于C2線，則該血清的抗體水平判斷就以C2線為準(zhǔn)，具體方法是：如果T線線條寬度和顏色深淺是C2線的1/3，則抗體水平為1:32，如果是1/2，則抗體水平為1:64，如果與C2相近則為1:128，其中1:32的抗體水平為臨界值，1:64以上為合格。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，按照生物統(tǒng)計(jì)學(xué)上的分析方法對(duì)檢測(cè)的各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析，P<0.05表示差異顯著和P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種前對(duì)照組和試驗(yàn)組的抗體滴度水平

表1 接種前對(duì)照組組與試驗(yàn)組組的抗體滴度水平

由表1可知，接種犬瘟熱-犬細(xì)小二聯(lián)疫苗前，對(duì)照組與試驗(yàn)組犬的抗體滴度水平基本相同，平均值皆為1:3，兩組的犬瘟熱抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率都為0。T檢驗(yàn)顯示兩組間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 免疫接種后7d對(duì)照組和試驗(yàn)組的抗體滴度水平

表2 免疫接種后7d各組的抗體滴度水平

由表2可知，接種疫苗后7d，試驗(yàn)組抗體滴度的平均水平達(dá)到1:29.5，比對(duì)照組提高了48.14%。對(duì)照組陽(yáng)轉(zhuǎn)率為33.3%，試驗(yàn)組陽(yáng)轉(zhuǎn)率為66.7%，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，陽(yáng)轉(zhuǎn)率提高約2倍。T檢驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。

2.3 免疫接種后14d對(duì)照組和試驗(yàn)組的抗體滴度水平

接種疫苗后14d，對(duì)照組抗體滴度平均水平為1:22.5，試驗(yàn)組抗體滴度的平均水平達(dá)到1:45。對(duì)照組陽(yáng)轉(zhuǎn)率為66.7%，試驗(yàn)組陽(yáng)轉(zhuǎn)率為83.3%，試驗(yàn)組比對(duì)照組相提高了16.6%(見表3)。T檢驗(yàn)結(jié)果顯示試驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。試驗(yàn)組抗體離散度縮小，在1:64~1:128之間。

表3 免疫接種后14d各組的抗體滴度水平

3 討論

據(jù)報(bào)道，目前有許多研究表明PHA可以與疫苗同時(shí)使用，能起到彌補(bǔ)免疫空白期、減緩疫苗應(yīng)激反應(yīng)、增強(qiáng)免疫效果的作用。莫非等人研究了植物血凝素(PHA)對(duì)雞免疫功能的影響，結(jié)果表明PHA對(duì)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫均有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，PHA對(duì)人工感染雞新城疫病毒有保護(hù)力[5]。陳東明等(2006)[6]報(bào)道利用PHA增強(qiáng)了小鼠特異性體液免疫的效應(yīng)。張明珠等(2009)[7]在試驗(yàn)植物血凝素對(duì)雞新城疫疫苗免疫效果的影響中，采用滴鼻的途徑，對(duì)肉用雛雞進(jìn)行新城疫Ⅳ系苗免疫接種過(guò)程中，同時(shí)輔助使用植物血凝素(PHA)，可明顯提高機(jī)體特異性抗體的水平，因而能夠有效地增強(qiáng)雞新城疫疫苗的免疫效果。

通過(guò)對(duì)健康犬注射犬瘟熱-犬細(xì)小二聯(lián)苗，同時(shí)口服PHA復(fù)合物，測(cè)定犬免疫效果的變化，發(fā)現(xiàn)在免疫接種前2組抗體滴度水平基本相同，無(wú)免疫保護(hù)作用。接種疫苗后7d，對(duì)照組陽(yáng)轉(zhuǎn)率為33.3%，試驗(yàn)組陽(yáng)轉(zhuǎn)率為66.7%，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，陽(yáng)轉(zhuǎn)率提高約2倍。試驗(yàn)組抗體滴度的平均水平比對(duì)照組提高了48.14%。到免疫接種后14d，試驗(yàn)組抗體滴度的平均水平為1:45，達(dá)到了保護(hù)犬免受犬瘟熱病毒感染所需的基礎(chǔ)抗體滴度水平(1:32)。陽(yáng)轉(zhuǎn)率試驗(yàn)組與對(duì)照組相比提高了16.6%，且T檢驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。試驗(yàn)組抗體離散度縮小，在1:64~1:128之間。這表明給犬免疫注射犬瘟熱-犬細(xì)小二聯(lián)苗的同時(shí)，口服0.1mg/kg PHA復(fù)合物，可促進(jìn)機(jī)體對(duì)疫苗株感染做出免疫應(yīng)答，對(duì)幼犬抵抗犬瘟熱病毒的攻擊可能起到積極的預(yù)防作用，由此顯示PHA可以作為高效免疫增強(qiáng)劑與疫苗合用來(lái)提高疫苗的免疫效果。

接種疫苗后14d，對(duì)照組陽(yáng)轉(zhuǎn)率為66.7%，試驗(yàn)組陽(yáng)轉(zhuǎn)率為83.3%，效果不明顯，為了加強(qiáng)免疫效果還要進(jìn)行二免，甚至三免。提高幼犬對(duì)犬瘟熱病毒病的抵抗力。

肖嘯等(2011)[8]給不同試驗(yàn)組豬肌注低劑量(0.2ml/kg)、中劑量(0.4ml/kg)、高劑量(0.8ml/kg)的PHA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，低劑量組和中劑量組淋巴細(xì)胞都有了不同程度的提高，但中劑量組提高的較高，顯示適量的PHA能顯著地促進(jìn)淋巴細(xì)胞提高，增強(qiáng)免疫功能。另有學(xué)者報(bào)道，PHA對(duì)雞新城疫，豬圓環(huán)病毒病、豬傳染性胃腸炎、非典型豬瘟等有免疫促進(jìn)作用[9,10]，與本研究的結(jié)果基本一致。在實(shí)際免疫中，為更好地抵御犬瘟熱病毒的感染，還需要在首次免疫后的2~3周進(jìn)行加強(qiáng)免疫。本試驗(yàn)因條件限制，未能開展攻毒和中和試驗(yàn)，以及不同劑量梯度的對(duì)比試驗(yàn)，所以對(duì)免疫保護(hù)時(shí)間能提前多少天，最適宜的口服劑量等問(wèn)題，還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

（1）對(duì)犬注射犬瘟熱-犬細(xì)小二聯(lián)苗，同時(shí)口服一定劑量PHA復(fù)合物，能極顯著提高機(jī)體抗體滴度水平，陽(yáng)轉(zhuǎn)率也得到較大提高，且離散度明顯縮小，免疫效果更好。（2）給犬免疫注射犬瘟熱-犬細(xì)小二聯(lián)苗，同時(shí)口服PHA復(fù)合物，可促進(jìn)機(jī)體對(duì)疫苗株感染做出免疫應(yīng)答，對(duì)犬抵抗犬瘟熱病毒的攻擊可能起到積極的預(yù)防作用，由此顯示PHA可以作為高效免疫增強(qiáng)劑與疫苗合用來(lái)提高疫苗的免疫效果。

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（2011–11–03）

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