陳國花 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 266600）

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H3N2亞型豬流感病毒多克隆抗體的制備及間接ELISA方法的建立

陳國花 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 266600）

本試驗將初步純化的H3N2豬流感病毒注入到新西蘭大白兔體內(nèi)，獲得了抗豬流感病毒多克隆抗體，以純化后的豬流感病毒為抗原，初步建立了間接ELISA檢測方法，確定了抗原最佳包被濃度為41.25μg/ml，血清的最佳稀釋度為1:400，酶標抗體的最佳稀釋度為1:1000，一抗的最佳作用時間為30min。

H3N2 豬流感病毒 多克隆抗體 間接ELISA

豬流感(Swine Influenza , SI)是全世界養(yǎng)豬國家常遇到的一種呼吸道疾病[1]。SIV屬正粘病毒科A型流感病毒[2]，對呼吸道上皮細胞具有高度親嗜性，故SIV感染的主要部位是支氣管和細支氣管上皮；呼吸道末梢部分的黏膜感染是誘發(fā)豬肺炎的重要原因。豬具有AIV和人流感病毒的受體，成為毒株間基因重配的活載體[3]，因此豬在流感病毒的禽-豬-人的種間傳播過程中，扮演著流感病毒中間宿主和多重宿主的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)、紫外分光光度計UV2550(日本島津公司)、5ml注射器、漩渦震蕩器MM-1(恒豐儀器廠)。

1.1.2 主要試劑 H3N2亞型的SIV、新鮮雞紅細胞、甲醛、生理鹽水、弗氏不完全佐劑(FIA)弗氏完全佐劑(FCA)(Sigma公司)、HRP標記的羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)。試劑由諸城市畜牧局檢測中心實險室保存。

1.1.3 試驗動物 雞1只、新西蘭大白兔2只。

1.2 方法

1.2.1 SIV的純化 甲醛處理的紅細胞吸附釋放法。（1）取1ml 50%新鮮雞紅細胞加入1ml36%甲醛，充分混勻。（2）置4℃48h，每隔3h混勻1次。（3）2000rpm離心10min后棄去上清，剩余沉淀物中加入10ml生理鹽水混勻。（4）2000rpm離心10min后棄去上清，然后加入10ml生理鹽水進行再次洗滌，重復洗滌6次。（5）加500ml生理鹽水配成50%甲醛處理過的雞紅細胞懸液。（6）取現(xiàn)有的SIV15ml，2000rpm離心30min后去沉渣，收集上清液。（7）取600ml 50%甲醛處理過的雞紅細胞懸液加入剛收集的上清液中，混勻，置4℃40min。（8）1500rpm離心10min后棄上清(另外收集該上清測血凝效價)。（9）殘留沉淀物中加入500ml生理鹽水，37℃水浴4h，每隔20min震搖1次。（10）1500rpm離心10min后收取上清并檢測血凝效價。

1.2.2 SIV濃度的測定 用生理鹽水作空白對照，紫外分光光度計測定純化的SIV的OD280nm，OD260nm，計算SIV濃度。計算公式為：病毒濃度(mg/ml)=1.45×OD280nm-0.74×OD260nm。

1.2.3 多克隆抗體的制備 取2只2.5~3kg新西蘭大白兔，用純化的SIV與等量弗氏完全佐劑完全乳化后，脊柱兩側(cè)選6~8點皮下注射，2mg/只。二免、三免、四免分別于首免后2、4和6周用弗氏不完全佐劑與SIV乳化后作為抗原進行注射，部位相同，3mg/只。四免后心臟采血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 間接ELISA反應程序 （1）包被：將抗原用包被液稀釋，加入96孔板，100μl/孔，置濕盒，4℃過夜。（2）洗滌：甩干包被液，用PBST洗滌3~5次，3~5min/次。（3）封閉：加入封閉液，100μl/孔，置濕盒，37℃孵育1h，甩干，同上洗滌。（4）加樣：血清用抗體稀釋液適當稀釋，100μl/孔，置濕盒，37℃孵育1h，甩干，同上洗滌。（5）加二抗：用二抗稀釋液將HRP標記的羊抗兔IgG稀釋至工作濃度，100μl/孔，置濕盒，37℃孵育1h，甩干，同上洗滌。（6）加底物：每孔加入新鮮配制的底物溶液，100μl/孔，避光顯色10min。（7）終止：加入2M H2SO4，50μl/孔，終止反應。（8）測OD值：用自動酶標儀測定各孔OD490 nm。

1.2.5 最佳抗原和血清濃度的確定 以方陣法測定，將抗原自50、100、200、400、800、1600倍稀釋包被酶標板，將陰陽性血清自100、200、400、800、1600、3200倍稀釋酶標板，作ELISA測定，用酶標板測定490nm波長下的OD值。取P/N最大，陽性OD490nm值在1.0附近，稀釋倍數(shù)為最佳的抗原濃度，該點對應的抗體稀釋度為最佳的抗體稀釋度。

1.2.6 二抗最佳稀釋度試驗 以最適抗原包被濃度包被酶標板，倒掉包被液，PBST洗滌4次，3~5min/次。封閉液封閉3h，PBST洗滌4次。血清按最佳稀釋度加入后反應60min，PBST洗滌4次，兔抗豬IgG-HRP選擇1:500、1:1000、1:1500、1:2000四個稀釋度，作用完后加入底物來確定最佳的抗體稀釋度。

2 結(jié)果與分析

2.1 血凝效價

純化前SIV效價為2-9，純化后的SIV效價為2-9，前后保持一致。

2.2 病毒含量

紫外分光光度計測定純化的SIV的OD280nm=0.780，OD260nm=0.414。因此，病毒濃度(mg/ml)=1.45×OD280nm-0.74×OD260nm=1.45×0.780-0.74×0.414=0.825(mg/ml)。由于該濃度是稀釋5倍后的濃度，故原始濃度為4.125mg/ml。

2.3 最佳抗原和血清濃度

經(jīng)多次方陣試驗，當抗原1:100，血清1:400稀釋時，P/N最大，OD490nm值接近于1.0。所以選擇1:100為抗原最佳包被濃度(41.25μg/ml)，血清的最佳稀釋度為1:400。結(jié)果見表1。

表1 SIV最佳抗原包被濃度和最佳血清濃度的確定

2.4 酶標二抗最適稀釋度的確定

SIV抗原和血清都按照最佳稀釋度進行試驗，封閉液選擇最佳封閉液，HRP標記的羊抗兔IgG分別用1:500、1:1000、1:1500、1:2000四個稀釋度，結(jié)果見表2。

表2 二抗最佳稀釋度的確定

從表2可以看出，當二抗稀釋度為1:1000時，P/N比值最大，因此選擇酶標抗體的最佳稀釋度為1:1000。

2.5 一抗最佳作用時間的確定

將一抗選取30min，60min，90min，120min 4個作用時間進行試驗，結(jié)果見表3。

表3 血清最適結(jié)合時間的確定

從表3可以看出，當抗原抗體的作用時間為30min時P/N比值最大，因此確定一抗的最佳作用時間為30min。

2.6 特異性試驗

按照已建立的檢測方法，將豬細小(PPV)、豬圓環(huán)(PCV)、豬藍耳(PRRSV)包被ELISA板進行特異性反應的測定，結(jié)果見表4，從表4結(jié)果可以看出，與PPV、PCV、PRRSV的反應均呈陰性，無交叉反應性，表明該方法具有較好的特異性。

表4 間接ELISA方法的特異性試驗

3 討論與結(jié)論

病毒的純化一直是病毒學研究的一個難點，密度梯度離心是病毒純化最常用的方法[4,5]。該方法精密度較高，使用該方法如果密度梯度選擇恰當可以受到比較滿意的效果，但是該方法操作過程比較繁瑣，需要特殊儀器設備-超速離心機。雞紅細胞表面含有血凝素的受體唾液酸，血凝素可以與之結(jié)合并發(fā)生凝集，隨后在一定的溫度條件下流感病毒又可與雞紅細胞分離，而使用甲醛處理過的雞紅細胞無溶血現(xiàn)象，因此根據(jù)流感病毒的這一特性可以使用甲醛處理的紅細胞吸附釋放法來純化流感病毒。通過2種純化流感病毒方法的對比研究，認為甲醛處理的紅細胞吸附釋放法是一種操作簡單，易于掌握，而且對設備要求不高，經(jīng)濟實用的純化流感病毒的方法，值得推廣，特別是使用甲醛處理過的雞紅細胞純化效果更理想。

ELISA盡管具有高靈敏、強特異的優(yōu)點，但是其結(jié)果卻受操作影響很大，每個步驟包括加樣、溫育、洗滌、顯色，都有可能對試驗結(jié)果產(chǎn)生不利影響。如洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也可能決定著試驗的成敗。ELISA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應過程中非特異性的吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料等對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性的干擾物質(zhì)洗滌下來。如果洗滌不徹底，特別是在最后一次，如有酶結(jié)合物的非特異性吸附，將使空白值升高?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是一個關鍵技術(shù)，但是大家往往會忽略，這應引起高度重視。

[1] 盧中華, 王自振, 王亞賓等. 豬流行性感冒[J]. 河南畜牧獸醫(yī). 2001 增刊. 86-88.

[2] 斯特勞.趙德明等譯. 豬病學(第8版)[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社, 2000, 665-669.

[3] Joe Vansickle Sr. Swine flu ranks third in pneumonia cases. National Hog Farmer.Nov 15, 2000. Vol. 45, Iss. 11; p. 14 (2 pages).

[4] 陳麗軍, 王英, 胡建華等. 應用等密度梯度離心法提純傳染性支氣管炎病毒[J]. 上海農(nóng)業(yè)學報, 1998, 14(3):93-95.

[5] Lee KC, Lim D, Wong SM, et al.Purification, crystallization and X-ray analysis of hibiscus chlorotic ringspot virus[J]. Acta Crystallogr, 2003, 59(8):1481-1483.

（2011–11–14）

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1007-1733(2012)02-0003-04