李 臻，吳 暉，賴富饒，李曉鳳

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640)

溪黃草多酚的超聲提取及其抗氧化性的研究

李 臻，吳 暉，賴富饒*，李曉鳳

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640)

采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)溪黃草多酚的超聲提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。通過Folin－Ciocalteu法對(duì)提取液的總酚進(jìn)行測(cè)定。考查了乙醇濃度、料液比、提取溫度、超聲功率、提取時(shí)間等五個(gè)因素對(duì)溪黃草多酚超聲提取率。結(jié)果表明:溪黃草多酚超聲提取的最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比(g∶mL)1∶10，提取溫度40℃，超聲功率250W，提取時(shí)間25min，在最佳工藝條件下多酚提取率達(dá)6.81%±0.11%。DPPH抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示溪黃草多酚具有明顯的DPPH自由基清除能力，其IC50值為38.47μg/mL。

溪黃草，多酚，超聲提取，自由基清除能力

溪黃草(Rabdosiaserra(Maxim.)Hara)，又名熊膽草、血風(fēng)草等，多年生草木，為唇形科香茶菜屬植物線紋香茶菜的全草，主產(chǎn)于長(zhǎng)江以南的湖南、四川、云南、江西、廣東、廣西等省區(qū)。其性甘苦、涼，可清熱，利膽，退黃，治急性黃疸型肝炎，急性膽囊炎［1］。溪黃草主要含萜類、黃酮類、酚類、氨基酸等多種化學(xué)成分。多酚具有較強(qiáng)的清除自由基、抗氧化活性、抗腫瘤、抗輻射以及保護(hù)心血管系統(tǒng)等重要的生物活性功能［2］，鑒于多種慢性病及退行性疾病與體內(nèi)的氧自由基過剩有關(guān)，因此從溪黃草中提取酚類化合物，并評(píng)價(jià)其抗氧化性強(qiáng)弱就顯得非常有必要［3］。超聲在20世紀(jì)50年代被應(yīng)用于提高提取率［4］，它也被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中的乳化、結(jié)晶化和冷凍［5］。超聲波在溶劑中的傳播產(chǎn)生了一種空穴現(xiàn)象，空化氣泡不斷產(chǎn)生并被壓縮，使得溶劑更易滲透入植物原材料并通過破碎細(xì)胞壁而釋放細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物，從而使得有機(jī)化合物的提取率提高［6］。超聲波已被多個(gè)研究證明能夠顯著地減少提取時(shí)間、增加提取率從而促進(jìn)許多植物原材料活性成分的提?。?－10］。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

溪黃草 廣州萬怡藥房五山店;DPPH(2，2－Diphenyl－l－picrylhydrazyl)、福林酚試劑(Folin－Ciocalteu) 美國(guó)Sigma公司;沒食子酸、無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、無水碳酸鈉 均為分析純。

DFY－300型300克搖擺式高速中藥粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司;SHZ－D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限公司;RE－52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮系列化儀器廠;TGL－16B型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;LSHZ－300型低溫水浴培養(yǎng)箱 常州諾基儀器有限公司;KQ－250DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司; Spectrum lab 752S型紫外可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溪黃草多酚超聲提取工藝［11］10g溪黃草→粉碎→乙醇溶液超聲提取→濾紙過濾→0.45μm濾膜抽濾→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除乙醇→加水補(bǔ)充溶液至50mL→加入50mL乙酸乙酯→室溫振蕩過夜→棄去水層→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干→50%甲醇溶解定容至50mL→稀釋后測(cè)定

1.2.2 單因素和正交實(shí)驗(yàn) 通過研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、超聲功率、提取時(shí)間對(duì)溪黃草多酚提取率的影響等單因素實(shí)驗(yàn)后，設(shè)計(jì)4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)［12］，見表1，優(yōu)化溪黃草多酚提取工藝條件。選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲功率、提取時(shí)間四個(gè)因素，設(shè)計(jì)9組不同組合實(shí)驗(yàn)，從中篩選出最佳提取條件。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平Tabel 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.2.3 總酚提取率測(cè)定 根據(jù) Folin－Ciocalteu法［13－14］對(duì)提取液的總酚含量進(jìn)行測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:稱取0.01g沒食子酸于10m L容量瓶，用50%甲醇定容至刻度。分別取60、120、180、240、300、360μL于6個(gè)10m L容量瓶，以50%甲醇定容到刻度，配制成濃度為 6、12、18、24、30、36μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)液。分別取0.5m L不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，加入0.2m L Folin－Ciocalteu試劑，混勻。室溫放置10m in后加入2m L質(zhì)量濃度為7%的碳酸鈉溶液，混勻，室溫放置15min。在波長(zhǎng)750nm處測(cè)量其吸光度。根據(jù)測(cè)量結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程:Y=0.003X，R2=0.999。式中，Y為待測(cè)樣液的吸光度;X為樣液總酚含量(μg/m L)。

總酚含量測(cè)定:將提取液用50%甲醇稀釋適當(dāng)倍數(shù)，按上述方法測(cè)定各提取物中總酚含量，每組平行測(cè)量3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及稀釋倍數(shù)，計(jì)算多酚提取率，計(jì)算公式如下:

式中，Z為多酚提取率(%);n為稀釋倍數(shù);X為樣液總酚含量(μg/m L);V為提取液體積(m L);m為溪黃草質(zhì)量(g)。

1.2.4 DPPH自由基清除能力測(cè)定［15－16］將已知總酚含量的溪黃草提取液稀釋至200μg/m L，再依次用50%甲醇溶液梯度稀釋，配成總酚濃度分別為100、50、25、12.5、6.25μg/m L的溶液，按照下述步驟，對(duì)6組不同總酚濃度提取液分別進(jìn)行DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)。

以50%甲醇為空白對(duì)照組，分別吸取1m L 50%甲醇和1m L提取液于不同試管中，各加入1m L 50μg/m L的DPPH甲醇溶液，混勻，避光放置20m in。以蒸餾水調(diào)零，于517nm測(cè)量吸光度。DPPH自由基清除率按如下公式計(jì)算:

式中，X為空白對(duì)照組的吸光度;Y為樣品溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取效果的影響 固定料液比1∶10，提取溫度40℃，超聲功率250W，提取時(shí)間15m in，分別選取乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%進(jìn)行超聲提取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，乙醇濃度不同，提取液極性不同，從而浸提酚類物質(zhì)的能力也不相同［17］。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，多酚提取率達(dá)最大值;當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加時(shí)，溶液極性增強(qiáng)，導(dǎo)致多酚類物質(zhì)的溶解度下降，多酚提取率呈減小趨勢(shì)。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%最為適宜。

圖1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)溪黃草多酚提取效果的影響Fig.1 Effect of ethanol concentrations on extraction efficiency of polyphenols from Rabdosiaserra(Maxim.)Hara

2.1.2 料液比對(duì)多酚提取效果的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取溫度40℃，超聲功率250W，提取時(shí)間15min，分別選取料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25進(jìn)行超聲提取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖2。由圖2可知，浸提液用量增加，傳質(zhì)推動(dòng)力增加，有利于提取。但當(dāng)料液比超過1∶10后，多酚提取率增加不明顯，且用量過大會(huì)增加后續(xù)工藝的難度，能耗較高，也會(huì)加大多酚的損失［18］。因此從經(jīng)濟(jì)角度考慮，1∶10為最適料液比，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用該比例。

2.1.3 提取溫度對(duì)多酚提取效果的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶10，超聲功率250W，提取時(shí)間15min，分別選取超聲溫度20、30、40、50、60℃進(jìn)行超聲提取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在20～40℃范圍內(nèi)，溫度的升高增加了溶劑分子和溶質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)了擴(kuò)散作用，故多酚提取率增大;而當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)多酚，提取率則呈下降趨勢(shì)，這主要是由于多酚是熱敏性物質(zhì)，易受熱而發(fā)生氧化，導(dǎo)致提取率下降。當(dāng)提取溫度為40℃時(shí)，多酚提取率達(dá)最大值。因此，40℃為最佳提取溫度。

2.1.4 超聲功率對(duì)多酚提取效果的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶10，提取溫度40℃，提取時(shí)間15m in，分別選取超聲功率 150、175、200、225、250W進(jìn)行超聲提取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著功率的增大，超聲波對(duì)細(xì)胞壁的破碎作用增強(qiáng)，胞內(nèi)多酚溶出速率增加，故其提取率逐漸增大［17］，當(dāng)超聲功率為225W時(shí)，多酚提取率達(dá)最大值;當(dāng)功率繼續(xù)增大到一定程度時(shí)，會(huì)造成局部溫度過高，多酚類物質(zhì)易在高溫條件下發(fā)生降解和氧化［19］，使多酚提取率反而降低。故225W為最適超聲功率。

圖2 不同料液比對(duì)溪黃草多酚提取效果的影響Fig.2 Effect of solid－liquid ratios on extraction efficiency of polyphenols from Rabdosiaserra(Maxim.)Hara

圖3 不同提取溫度對(duì)溪黃草多酚提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction temperatures on extraction efficiency of polyphenols from Rabdosiaserra(Maxim.)Hara

圖4 不同超聲功率對(duì)溪黃草多酚提取效果的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction efficiency of polyphenols from Rabdosiaserra(Maxim.)Hara

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)多酚提取效果的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶10，提取溫度40℃，超聲功率225W，分別選取提取時(shí)間5、10、15、20、25m in進(jìn)行超聲提取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖5。由圖5可知，當(dāng)超聲時(shí)間為20m in時(shí)，多酚提取率達(dá)最大值;隨著時(shí)間增大，多酚提取率有逐漸減小趨勢(shì)，這可能是因?yàn)槌暡ň哂休^強(qiáng)的剪切作用，長(zhǎng)時(shí)間的作用使得多酚的分子結(jié)構(gòu)被破壞，從而提取率降低［17］。故最佳超聲時(shí)間為20m in。

圖5 不同提取時(shí)間對(duì)溪黃草多酚提取效果的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction efficiency of polyphenols from Rabdosiaserra(Maxim.)Hara

2.2 正交法優(yōu)化提取條件的實(shí)驗(yàn)

按照表1中數(shù)據(jù)進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果見表2、表3。

分析正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，最佳條件為A2B2C3D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶10，提取溫度40℃，超聲功率250W，提取時(shí)間25m in時(shí)，溪黃草超聲提取的多酚得率最高。其中，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度對(duì)提取得率影響最為顯著，超聲功率和提取時(shí)間差異不顯著。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array designmatrix and experimental results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance of orthogonal array design experimental results

在正交實(shí)驗(yàn)表中并沒有用到A2B2C3D3組合，因此需要在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證。在最佳提取條件下，反復(fù)提取3次以驗(yàn)證提取效果，測(cè)得多酚得率為6.81%±0.11%。

2.3 DPPH自由基清除能力測(cè)定

DPPH(2，2－Diphenyl－l－picrylhydrazyl)自由基是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，通過檢測(cè)樣液對(duì)DPPH自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的強(qiáng)弱［20］。由圖6可知，溪黃草多酚能夠清除DPPH自由基，具有很好的抗氧化性能。隨著總酚濃度的增大，自由基清除率相應(yīng)增大，當(dāng)總酚濃度大于100μg/m L時(shí)，DPPH自由基趨近于完全被清除，且在一定濃度范圍內(nèi)，總酚濃度與DPPH自由基清除能力呈一定的效量關(guān)系，其線性關(guān)系為Y=1.395X－3.670，R2=0.999，其中，Y為DPPH自由基清除率(%)，X為樣液總酚含量(μg/m L)。根據(jù)線性關(guān)系，可知溪黃草多酚提取液的IC50=38.47μg/m L。

圖6 溪黃草多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging capability of polyphenol extracted from the Rabdosiaserra(Maxim.)Hara

3 結(jié)論

3.1 溪黃草多酚的超聲提取受眾多因素影響，根據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析表明，提取的最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶10(g∶m L)，提取溫度40℃，超聲功率250W，提取時(shí)間25m in。該條件下，多酚提取率可達(dá)6.81%±0.11%。超聲波法的多酚提取率較高，可節(jié)省大量的時(shí)間和資源，是一種快捷、簡(jiǎn)便、有效的提取方法，為進(jìn)一步利用溪黃草多酚提供了有益的參考。

3.2 自由基是機(jī)體正常代謝過程中的產(chǎn)物，具有強(qiáng)氧化性，機(jī)體內(nèi)自由基過剩時(shí)可引起脂質(zhì)過氧化及生物膜損壞等，導(dǎo)致腫瘤及心腦血管等疾?。?1］。實(shí)驗(yàn)表明，溪黃草多酚具有抗氧化作用，能夠有效地清除DPPH自由基，其IC50值為38.47μg/m L。因此，溪黃草多酚有著很大的開發(fā)潛力，在食品、制藥工業(yè)以及保健品行業(yè)都具有良好的應(yīng)用前景。

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Study on ultrasonic extraction and antioxidant activity of polyphenol fromRabdosiaserra(Maxim.)Hara

LIZhen，WU Hui，LAI Fu－rao*，LIXiao－feng
(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

An orthogonal array design was used to op tim ize the ultrasonic extrac tion conditions ofRabdosiaserra(Maxim.)Hara.The total polyphenol content was determ ined by the Folin－Ciocalteu assay，and the influence of ethanol concentration，solid－liquid ratio，temperature，ultrasonic power and time on the extraction efficiency were studied.Results showed that the op timum extraction conditions were as follows:25m in ultrasonic treatment at 250W power for extracting the raw materialwith a 10－fold volume of 60%aqueous ethanol solution at 40℃.The yield of polyphenolwas 6.81%±0.11%under the op timum cond ition.The DPPH rad ical scavenging capability assay showed that theRabdosiaserra(Maxim.)Hara had strong radical scavenging capability，and its IC50value was 38.47μg/m L.

Rabdosiaserra(Maxim.)Hara;polyphenol;ultrasonic extraction;radical scavenging capability

TS201.1

B

1002－0306(2012)12－0258－04

2011－10－25 *通訊聯(lián)系人

李臻(1989－)，女，在讀碩士，研究方向:食品安全與天然產(chǎn)物化學(xué)。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(2011ZB0012);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20906031);教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃資助項(xiàng)目(NECT－06－0746)。