李海方，張 濤，江 波，繆 銘，沐萬孟，吳保承，楊春霞，侯傳林

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122)

馬克斯克魯維酵母乳糖酶水解和轉(zhuǎn)移性質(zhì)比較

李海方，張 濤，江 波*，繆 銘，沐萬孟，吳保承，楊春霞，侯傳林

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122)

主要對(duì)馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)產(chǎn)β－D－半乳糖苷酶的水解性質(zhì)和轉(zhuǎn)移酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了比較。對(duì)比發(fā)現(xiàn)溫度、pH、金屬離子以及葡萄糖和半乳糖濃度對(duì)該酶的兩種性質(zhì)有不同影響，同時(shí)還研究了酶的動(dòng)力學(xué)特性，以O(shè)NPG為底物，測(cè)得馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶的Km為0.51mmol/L，Vmax為0.532μmol/(mg protein·min)。以乳糖為底物，Km為0.56mmol/L，Vmax為0.31μmol/(mg protein·min)。這對(duì)研究生產(chǎn)低聚半乳糖有重要作用。

馬克斯克魯維酵母，β－D－半乳糖苷酶，水解性質(zhì)，轉(zhuǎn)移性質(zhì)

低聚半乳糖(GOS)是由2～10個(gè)半乳糖基和葡萄糖基通過糖苷鍵連接而成的功能性低聚糖［1］，作為母乳組成成分之一，它能夠選擇性促進(jìn)人體腸道內(nèi)益生菌的增殖［2］，有抑制腐敗菌生長(zhǎng)［3］、減少有害代謝產(chǎn)物形成、防止便秘等功效，同時(shí)它還具有低甜度、低能量［4］、抗齲齒、對(duì)熱和酸穩(wěn)定等特性［5］。β－D－半乳糖苷酶屬于水解酶(EC3.2.1.23)，能夠催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖，該酶還可以催化半乳糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，生成低聚半乳糖［6］。目前生產(chǎn)低聚半乳糖的方法，主要是通過微生物發(fā)酵產(chǎn)β－D－半乳糖苷酶，以乳糖為底物利用酶的轉(zhuǎn)移活性來合成產(chǎn)物［7－8］。不同微生物產(chǎn)的酶在水解和轉(zhuǎn)移方面有不同的性質(zhì)［9－12］，本實(shí)驗(yàn)研究了馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶的水解和轉(zhuǎn)移活性，并進(jìn)行了比較，從而為下一步合成低聚半乳糖反應(yīng)提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、乳糖、半乳糖、鄰硝基苯－β－D－吡喃半乳糖苷(ONPG)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、EDTA 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Agilent1200高效液相色譜儀 配有Shodex RI－101示差折光檢測(cè)器和 M740數(shù)據(jù)處理器，美國(guó)Agilent公司;高壓細(xì)胞破碎儀 英國(guó)Constant System公司;恒溫水浴鍋 華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司;722E型分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母培養(yǎng)及酶的提取 種子培養(yǎng)基:酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖40g/L，pH6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，乳糖20 g/L，pH6.5。

將馬克斯克魯維酵母接入種子培養(yǎng)基在30℃，200 r/m in條件下培養(yǎng)15h后接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為1%，同樣條件下培養(yǎng)15h發(fā)酵產(chǎn)酶。發(fā)酵結(jié)束后6000r/min離心得到菌體，將菌體用pH7.0 0.1mol/L的磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖液重懸后用高壓細(xì)胞破碎儀在4℃30KPSI條件下破碎菌體;8000 r/m in下離心20m in取上清液即得到粗酶液。向粗酶液中加入30%硫酸銨靜置4h后，8000r/min離心除去雜蛋白，再向體系中繼續(xù)添加硫酸銨至濃度為80%，4℃靜置10h后離心得到酶蛋白沉淀。沉淀用少量緩沖液溶解后透析48h除掉其中的銨離子。透析好的酶液通過DEAE－Sepharose fast flow離子交換柱除掉一部分雜蛋白，再通過Superdex 75 Prep Grade凝膠柱分離得到酶蛋白。收集的酶蛋白在SDS－PAGE上顯示為單一條帶，即得到的是純的β－D－半乳糖苷酶。將收集的純酶液濃縮，用于研究酶學(xué)性質(zhì)。

1.2.2 β－D－半乳糖苷酶水解活力測(cè)定方法 配制1mg/m L的ONPG溶液，取2m L溶液于35℃保溫10m in后加入酶液0.5m L，在35℃下準(zhǔn)確反應(yīng)15m in，加入2.5m L濃度為0.15mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，溶液靜置2m in后，于420nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出酶活。1m L酶液1m in催化ONPG生成1μmol鄰硝基酚(ONP)為一個(gè)單位酶活。

1.2.3 β－D－半乳糖苷酶轉(zhuǎn)移酶活測(cè)定方法 用pH7.0的0.1mol/L的磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖溶液配制0.5mol/L的底物乳糖溶液，取400μL底物溶液加入100μL酶液在40℃條件下準(zhǔn)確反應(yīng)4h后于沸水中煮沸5min終止反應(yīng)。每分鐘產(chǎn)生1μmol低聚半乳三糖為一個(gè)酶活力單位。

1.2.4 低聚半乳三糖檢測(cè)方法 高效液相色譜法(HPLC):Agilent1200系列，配有Shodex RI－101示差折光檢測(cè)器和 M740數(shù)據(jù)處理器;色譜柱，Shodex Asahipak NH2P－50;流動(dòng)相，乙睛∶水=68∶32，流速1m L/m in;柱溫30℃;進(jìn)樣量10μL。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定方法

1.2.5.1 溫度對(duì)酶水解和轉(zhuǎn)移酶活及穩(wěn)定性的影響

將酶在不同溫度下與ONPG和乳糖反應(yīng)，測(cè)定酶活力，以最高的酶活力為100%，其他條件下的酶活與其比較換算成相對(duì)酶活力。考察不同溫度對(duì)酶水解酶活和轉(zhuǎn)移酶活的影響。

將酶在不同溫度(30～50℃)下保溫10、20、30、60、120m in，測(cè)定酶活力，通過相對(duì)酶活的比較，考察溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。

1.2.5.2 pH對(duì)酶水解和轉(zhuǎn)移酶活及穩(wěn)定性的影響

將酶在不同pH下與ONPG和乳糖反應(yīng)，測(cè)定酶活力，以最高的酶活力為100%，其他條件下的酶活與其比較換算成相對(duì)酶活力?？疾觳煌琾H對(duì)酶水解活力和轉(zhuǎn)移酶活的影響。

將酶置于不同pH得磷酸緩沖液中，35℃保溫30m in，測(cè)定酶活力，以最高的酶活力為100%，其他條件下的酶活與其比較換算成相對(duì)酶活力?？疾觳煌琾H對(duì)酶水解酶活和轉(zhuǎn)移酶活的影響。

1.2.5.3 金屬離子對(duì)β－D－半乳糖苷酶水解和轉(zhuǎn)移酶活的影響 酶液先經(jīng)含有10mmol/L EDTA的Tris－HCl緩沖液于4℃透析12h以去除溶液中帶有的金屬離子;然后再經(jīng)不含EDTA的Tris－HCl緩沖液于4℃透析48h以去除殘留EDTA;最后在處理過的酶液中分別加入不同的二價(jià)金屬離子及化合物(K+、Na+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Mg2+、Fe2+、EDTA)使得其終濃度為10mmol/L。分別測(cè)定水解酶活和轉(zhuǎn)移酶活，以未加金屬離子或化合物的酶液活力為100%。

1.2.5.4 葡萄糖和半乳糖對(duì)酶水解和轉(zhuǎn)移酶活的影響 向底物中分別加入濃度為 0.05、0.1、0.2和0.4mol/L的葡萄糖和半乳糖，以不添加測(cè)得的酶活力為100%，其他條件下的酶活力與其比較換算成相對(duì)酶活?？疾炱咸烟呛桶肴樘菍?duì)酶水解酶活和轉(zhuǎn)移酶活的影響。

1.2.5.5 乳糖酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 以O(shè)NPG為底物，分別配制1～8.33mmol/L不同濃度的溶液，在35℃測(cè)定酶活，按雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver－Burk法)求米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)乳糖酶水解和轉(zhuǎn)移酶活及穩(wěn)定性的影響

由圖1可知，馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶水解活力在35℃時(shí)最大，而轉(zhuǎn)移酶活力在40℃時(shí)最大，當(dāng)溫度＞45℃時(shí)，酶的轉(zhuǎn)移活力迅速降低。生產(chǎn)低聚半乳糖的酶反應(yīng)過程主要依靠酶的轉(zhuǎn)移性質(zhì)，酶的轉(zhuǎn)移活力高時(shí)，低聚半乳糖轉(zhuǎn)化率會(huì)明顯提高，而水解酶活高時(shí)會(huì)增加反應(yīng)副產(chǎn)物葡萄糖和半乳糖的產(chǎn)量，低聚半乳糖轉(zhuǎn)化率會(huì)降低。因此在生產(chǎn)低聚半乳糖的酶反應(yīng)過程中，應(yīng)該以轉(zhuǎn)移酶活的最適條件為首要考慮因素。

圖1 溫度對(duì)酶水解和轉(zhuǎn)移酶活的影響Fig.1 Effect of temperature on hydrolysis and transgalactose activity ofβ－D－galactosidase

由圖2可知，馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶在35～40℃之間保溫1h，水解酶活力和轉(zhuǎn)移酶活力能保持80%以上，隨著溫度升高時(shí)間延長(zhǎng)，酶活力會(huì)持續(xù)降低。溫度達(dá)到50℃時(shí)，酶水解活力損失較快，保溫3h后殘余水解酶活為37%，殘余轉(zhuǎn)移酶活為20%。

圖2 溫度對(duì)酶水解和轉(zhuǎn)移酶活力穩(wěn)定性的影響Fig.2 Curve of thermal stability on the enzyme

2.2 pH對(duì)酶水解和轉(zhuǎn)移活性及穩(wěn)定性的影響

由圖3可以看出，馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶在pH7.0的條件下酶水解和轉(zhuǎn)移酶活最高，轉(zhuǎn)移酶活對(duì)pH敏感性比水解酶活弱一些，在6.5～7.0的范圍內(nèi)能保持較高活性。低聚半乳糖pH呈酸性，在合成反應(yīng)中，pH會(huì)不斷下降，因此pH要控制在保持酶活力的范圍內(nèi)。

圖3 pH對(duì)酶水解和轉(zhuǎn)移酶活的影響Fig.3 Effect of pH on hydrolysis and transgalactose activity ofβ－D－galactosidase

由圖4可以看出，馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶轉(zhuǎn)移酶活在pH6.0～7.0之間穩(wěn)定性比水解酶活高，而當(dāng)pH＞7.0時(shí)轉(zhuǎn)移酶活迅速降低，而水解酶活降低較緩慢。在合成低聚半乳糖的反應(yīng)中，要保持較高的轉(zhuǎn)移活性，因此酶在處理過程中pH要控制在6.5～7.0之間，防止酶轉(zhuǎn)移活性降低。

圖4 pH對(duì)酶水解和轉(zhuǎn)移酶活力穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH on hydrolysis and transgalactose activity ofβ－D－galactosidase’s stability

2.3 金屬離子對(duì)β－D－半乳糖苷酶水解和轉(zhuǎn)移活性的影響

由圖5可知 Ni2+、Cu2+、Ca2+、Fe2+、Zn2+、EDTA在酶反應(yīng)體系中使馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)移活性完全失去;Mn2+、K+使得酶轉(zhuǎn)移活力降低了50%以上，Co2+使酶轉(zhuǎn)移活力降低了20%，Na+使酶轉(zhuǎn)移活力降低了10%。Mg2+對(duì)酶轉(zhuǎn)移活力有激活作用，相對(duì)酶活為125%。EDTA、Cu2+能夠使酶活力完全喪失;Na+、Ni2+、Ca2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+、Co2+使水解酶活降低了50%以上，K+對(duì)酶水解活力沒有影響，Mg2+對(duì)酶水解活力有激活作用。在合成低聚半乳糖的反應(yīng)中，需要酶有較高的轉(zhuǎn)移活力，Ni2+、Cu2+、Ca2+、Fe2+、Zn2+、EDTA會(huì)是反應(yīng)的強(qiáng)烈抑制劑，而向體系中加入適當(dāng)濃度的Mg2+可以減少酶用量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Na+能夠抑制酶的水解活力，而對(duì)轉(zhuǎn)移酶活影響較小，在合成低聚半乳糖的反應(yīng)中，可以利用這一性質(zhì)進(jìn)行研究，減少水解反應(yīng)副產(chǎn)物含量提高低聚半乳糖轉(zhuǎn)化率。

2.4 葡萄糖和半乳糖對(duì)酶水解和轉(zhuǎn)移活性的影響

圖5 金屬離子對(duì)酶活性的影響Fig.5 Effect ofmetal ions on enzyme activity

由圖6可以看出，當(dāng)添加葡萄糖量大于0.1mol/L時(shí)可以促進(jìn)乳糖酶的水解活性，而添加半乳糖則會(huì)抑制β－D－半乳糖苷酶水解活性，且濃度越大抑制力越強(qiáng)。這樣可以看出在合成低聚半乳糖的反應(yīng)中，反應(yīng)產(chǎn)物半乳糖會(huì)抑制反應(yīng)向水解方向進(jìn)行。

圖6 葡萄糖和半乳糖對(duì)乳糖酶水解酶活的影響Fig.6 Effect of glucose and galactose on hydrolysis activity

由圖7可以看出，添加葡萄糖會(huì)抑制乳糖酶的轉(zhuǎn)移酶活，且添加量越大抑制力越強(qiáng)。添加半乳糖對(duì)轉(zhuǎn)移酶活影響較小，添加量為0.05mol/L時(shí)乳糖酶轉(zhuǎn)移酶活增加。反應(yīng)前期，未添加半乳糖的反應(yīng)，需要利用β－D－半乳糖苷酶的水解活性先將乳糖水解，得到半乳糖后再進(jìn)行轉(zhuǎn)移反應(yīng)得到低聚半乳糖。而在反應(yīng)體系中添加半乳糖，半乳糖作為反應(yīng)的底物，可以通過酶的轉(zhuǎn)移活力迅速反應(yīng)合成低聚半乳糖。

圖7 葡萄糖和半乳糖對(duì)乳糖酶轉(zhuǎn)移酶活的影響Fig.7 Effect of glucose and galactose on transgalactose activity

2.5 β－D－半乳糖苷酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

根據(jù)圖8顯示的線性回歸方程，可以求得馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶在以O(shè)NPG為底物時(shí)，Vmax為 0.532μmol/(mg protein·m in)、Km為0.51mmol/L。

根據(jù)圖9顯示的線性回歸方程，可以求得馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶在以乳糖為底物時(shí)，Vmax為 0.31μmol/(mg protein·m in)、Km為 0.56 mmol/L。

圖8 以O(shè)NPG為底物乳糖酶的Lineweaver－Burk圖Fig.8 Lineweaver－Burk plots of the enzyme using ONPG as substrate

圖9 以乳糖為底物乳糖酶的Lineweaver－Burk圖Fig.9 Lineweaver－Burk plots of the enzyme using lactose as substrate

3 結(jié)論

3.1 馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶水解酶活最適溫度為35℃，轉(zhuǎn)移酶活最適溫度為40℃，溫度大于45℃時(shí)酶轉(zhuǎn)移活力損失較快。該酶的水解和轉(zhuǎn)移酶活力最適pH相同，均為7.0，但pH穩(wěn)定性略有不同，水解酶活在pH6.5～8.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，轉(zhuǎn)移酶活在6.5～7.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定。

3.2 Mg2+對(duì)馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶水解酶活和轉(zhuǎn)移酶活均有激活作用，Na+能夠抑制酶的水解活力，而對(duì)酶轉(zhuǎn)移活力影響較小。

3.3 葡萄糖對(duì)馬克斯克魯維酵母β－D－半乳糖苷酶的水解活力有促進(jìn)作用，對(duì)酶轉(zhuǎn)移活性有抑制作用。半乳糖抑制酶的水解作用，低濃度(0.05mol/L)的半乳糖能夠促進(jìn)酶的轉(zhuǎn)移活性而濃度繼續(xù)增加對(duì)酶轉(zhuǎn)移活性幾乎沒有影響。

3.4 以O(shè)NPG為底物，測(cè)得馬克斯克魯維酵母β－D－半 乳 糖 苷 酶 的 Km為 0.51mmol/L，Vmax為0.532μmol/(mg protein·m in)。以乳糖為底物，Km為0.56mmol/L，Vmax為0.31μmol/(mg protein·min)。

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Com parison ofβ－D－galactosidase hydrolysis and transgalacosidation properties from Kluyverom yces marxianus

LIHai－fang，ZHANG Tao，JIANG Bo*，M IAO M ing，MU W an－meng，WU Bao－cheng，YANG Chun－xia，HOU Chuan－lin
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

This research comparedβ－D－galactosidase’s hyd rolytic and transg lucosidation p roperties fromKluyveromycesmarxianus.The com parison ind icated d ifferent tem perature，pH，metal ions g lucose and galactose concentration had d ifferent effec t onβ－D－galac tosidase’s hyd rolysis and transgalac tose ac tivity.This paper also studied the dynam ics of the enzyme.Taking ONPG as substrate，the Kmwas 0.51mmol/L，and the Vmaxwas 0.532μmol/(mg p rotein·m in).Taking lac tose as substrate，the Kmwas 0.56mmol/L，and the Vmaxwas 0.31μmol/ (mg p rotein·m in).All these studies can p lay an im portant role in p roducing GOS.

Kluyveromycesmarxianus;β－D－galactosidase;hyd rolysis;transgalactosidation

TS201.2

A

1002－0306(2012)12－0243－04

2011－09－26 *通訊聯(lián)系人

李海方(1986－)，女，碩士，研究方向:應(yīng)用酶技術(shù)。

科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金(10C26213201021)。