鐘 嬋，沈建東，蔡秋鳳，翁武銀，曹敏杰

(集美大學生物工程學院，福建廈門 361021)

鐘 嬋，沈建東，蔡秋鳳，翁武銀，曹敏杰*

(集美大學生物工程學院，福建廈門 361021)

在魚糜制品生產(chǎn)過程中，凝膠劣化現(xiàn)象是引起魚糜品質(zhì)下降的重要原因。研究表明，溶酶體中的內(nèi)源性組織蛋白酶B會促進肌原纖維蛋白的降解，進而導致魚糜凝膠劣化。迄今為止，多種魚體肌肉中的組織蛋白酶B已有研究，但海水經(jīng)濟低值魚藍圓鲹中該酶的情況卻尚未報道。本研究采用硫酸銨沉淀和柱層析相結合的方法，從藍圓鲹肌肉中分離純化得到分子量約為27ku的組織蛋白酶B。酶學性質(zhì)結果顯示，該酶最適溫度和最適pH分別為55℃和5.5，半胱氨酸蛋白酶抑制劑E－64能有效抑制其活性。對肌原纖維蛋白的降解實驗表明，在最適條件下，藍圓鲹組織蛋白酶B對肌原纖維蛋白有一定的降解作用。因此，組織蛋白酶B參與肌原纖維蛋白的降解，更可能參與在低pH條件下魚糜凝膠劣化。

藍圓鲹，組織蛋白酶B，性質(zhì)，肌原纖維蛋白

魚糜制品因口感和風味良好受到國內(nèi)外消費者的歡迎，2009年我國魚糜制品的總產(chǎn)量為84.7萬t，占總水產(chǎn)加工品總量的5.7%［1］。魚糜制品在生產(chǎn)過程中常在55～60℃的溫度帶內(nèi)產(chǎn)生因肌肉結構蛋白分解，導致的凝膠形成能力明顯下降的現(xiàn)象(凝膠劣化)。凝膠劣化不僅影響魚糜制品的彈性，更影響其商品價值。目前研究表明，酸性半胱氨酸蛋白酶［2－3］和堿性肌原纖維結合型絲氨酸蛋白酶［4－5］是導致魚糜劣化的主要內(nèi)源性蛋白酶。其中半胱氨酸蛋白酶主要指存在于肌肉細胞溶酶體中的組織蛋白酶L、B和H，在魚糜凝膠劣化中起著一定的作用。李樹紅［6］等人認為，鰱魚(Hypophthalmichthys molitrix)魚肉經(jīng)漂洗后仍殘留組織蛋白酶L、B和H的活性，其中組織蛋白酶L的殘留率為25.79%，組織蛋白酶B為11.46%，而組織蛋白酶 H只有 6.86%。Jiang等人［2，7］的研究表明，組織蛋白酶 B與 L對鯖魚(Scomber australasicus)的肌原纖維蛋白有著明顯的降解作用。Liu等人［8］發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B和L能夠破壞鰱魚魚糜凝膠的網(wǎng)狀結構，進而引起凝膠劣化現(xiàn)象。藍圓鲹作為一種重要的經(jīng)濟海水魚類，據(jù)統(tǒng)計，2009年的總量為54.0萬t［1］。由于海洋魚類資源的持續(xù)減少，海水紅色肉魚已成為有較高經(jīng)濟價值的魚種。但因其肌肉中紅色肉含量多，脂肪含量高，蛋白酶活性強，鮮度下降快等問題，紅色肉魚類的資源一直沒有得到合理的利用。因此，研究該魚類肌肉中的組織蛋白酶，尤其是探討導致魚體肌肉軟化的組織蛋白酶的性質(zhì)及其與肌原纖維蛋白降解的關系，可為解決魚糜生產(chǎn)過程中凝膠劣化問題提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮藍圓鲹(Decapterus maruadsi)、羅非魚(Oreochromis niloticus) 福建省廈門市集美菜市場; SP－Sepharose、Sephacryl S－200 HR層析樹脂 瑞典Amersham Biosciences公司;Z－Phe－Arg－MCA、Z－Arg－Arg－MCA等熒光底物 日本Peptide Institute公司;反－環(huán)氧丁二?；璍－亮氨酰胺基(4－胍基)(E－64)

美國Amresco公司;Chymostatin、Leupeptin 德國Roche公司;乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、N，N，N＇，N＇－四甲基乙二胺(TEMED)、溴酚蘭 美國Sigma公司;標準蛋白 立陶宛Fermentas公司;十二烷基硫酸鈉(SDS，電泳純)、二硫叔糖醇(DTT)、丙烯酰胺 美國Bio－Rad公司;其他試劑

均為國產(chǎn)分析純。

Avanti JA－25大型高速冷凍離心機 美國Beckman公司;BioPhotometer紫外分光光度計 德國Eppendorf公司;FP－6200熒光分光光度計 日本Jasco公司;G:BOX凝膠成像儀 英國Syngene公司; WB－14恒溫水浴鍋 德國Memmert公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織蛋白酶B的分離純化 藍圓鲹肌肉中組織蛋白酶B的分離純化主要參考Jiang等人［9］的方法，純化過程中的溶液均含有5mmol/L L－半胱氨酸。取新鮮的藍圓鲹骨骼肌加入4倍魚肉重量的50mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH4.5)(緩沖液A)進行組織搗碎，在8，000×g離心30min，用四層絹布過濾取其上清液。上清液經(jīng)過30%～70%硫酸銨鹽析后，沉淀用少量的緩沖液A溶解，在相同的緩沖液中充分透析脫鹽。將透析后的樣品上樣于事先用緩沖液A平衡的SP－Sepharose陽離子交換層析柱(2.5cm× 15cm)，緩沖液A流洗去除未吸附的蛋白，再用含0～1mol/L NaCl鹽濃度的緩沖液A進行線性洗脫，收集活性峰，用10ku截留膜超濾濃縮。將濃縮后的樣品上樣于用含有0.15mol/L NaCl的20mmol/L Tris－HCl緩沖液(pH7.0)(緩沖液 B)平衡的 Sephacryl S－200 HR凝膠過濾層析柱，收集活性峰，檢測純度及酶活力。

1.2.2 組織蛋白酶B活力的測定 組織蛋白酶活力測定主要參考Barrett等人［10］的方法。組織蛋白酶B以Z－Phe－Arg－MCA和Z－Arg－Arg－MCA為熒光底物，在0.1mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH5.5)中進行酶活測定，反應緩沖液中含1mmol/L EDTA和2mmol/L DTT。

具體步驟如下:在 900μL反應緩沖液中，將50μL酶液與50μL濃度為10μmol/L的熒光底物充分混合，在55℃水浴反應10min后立刻用1.5mL終止液終止反應。反應釋放出的7－氨基－4－甲基香豆素(7－amino－4－methycoumarin，AMC)用熒光分光光度計在激發(fā)光波長為380nm和發(fā)射光波長為450nm下進行測定。對照組的反應條件一致，除用緩沖液代替熒光底物。酶活力單位(Units)定義為每分鐘釋放1nmol AMC所需要的酶量。

1.2.3 組織蛋白酶B的性質(zhì)分析

1.2.3.1 溫度對酶活力的影響 溫度對酶活力的影響是在0.1mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH5.5)中，將組織蛋白酶B在不同溫度(20～70℃)下反應10min后，測定其酶活力。以反應溫度為橫坐標，組織蛋白酶B的相對酶活力為縱坐標作圖。

1.2.3.2 pH對酶活力的影響 pH對酶活力的影響是在0.1mol/L不同pH緩沖液(pH3.0～8.0)中，組織蛋白酶B在55℃下反應10min，測定其酶活力。以反應pH為橫坐標，組織蛋白酶B相對酶活力為縱坐標作圖。其中所用不同pH緩沖液為:0.1mol/L乙酸鈉緩沖液(pH3.0～5.5)、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0～7.0)和0.1mol/L Tris－HCl緩沖液(pH8.0)。

1.2.3.3 底物特異性研究 底物特異性是在0.1mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH5.5)中，組織蛋白酶 B與10μmol/L的不同類型的熒光底物混合均勻，按酶活測定方法測定其對不同類型底物的水解程度。以水解Z－Phe－Arg－MCA熒光底物為對照。所用熒光底物有:Z－Phe－Arg－MCA，Z－Arg－Arg－MCA，Arg－MCA，Boc－Phe－Ser－Arg－MCA，Boc－Gln－Arg－Arg－MC，Boc－Leu－Arg－Arg－MCA，Suc－Ala－Ala－Pro－Phe－MCA，Suc－Leu－Leu－Val－Tyr－MCA。

1.2.3.4 不同抑制劑對酶活力的影響 抑制劑對酶活力的影響是在0.1mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH5.5)中，組織蛋白酶B與不同類型的抑制劑混合均勻，在4℃下孵育30min后，測定其剩余的酶活力。對照樣品的反應條件一致，但不加任何抑制劑。所用抑制劑有:E－64、Chymostatin、Leupeptin、EDTA和PMSF。

1.2.4 組織蛋白酶B對肌原纖維蛋白的作用

1.2.4.1 肌原纖維蛋白的制備 由于藍圓鲹肌肉肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MF)在55℃下，其自身會發(fā)生明顯的降解［11］，因此，選擇自身降解較慢的羅非魚肌原纖維為蛋白降解底物更為合理。肌原纖維的制備主要參照Yanagihara等人［12］的方法。具體如下:新鮮藍圓鲹取其背部肌肉，加入4倍魚肉重量的20mmol/L Tris－HCl緩沖液(pH7.0)進行組織搗碎。在8，000×g離心10min，取沉淀部分重復上述步驟 4次后，沉淀部分用含 0.5mol/L NaCl的20mmol/L Tris－HCl緩沖液(pH7.0)充分溶解，懸濁液在12，000×g離心20min，用絹布過濾，取上清部分，即為肌原纖維蛋白。

1.2.4.2 組織蛋白酶 B對肌原纖維蛋白降解的影響 在含有0.5mol/L NaCl和5mmol/L L－半胱氨酸的0.1mol/L乙酸鈉緩沖液(pH5.5)中，將50μL濃度為6mg/mL的藍圓鲹 MF與30μL酶活力單位為20U/mg的組織蛋白酶B充分混合，在55℃下反應不同時間。時間梯度為:0、15、30、60、120、180、240、300min。孵育不同時間后，樣品與上樣緩沖液和5%巰基乙醇充分混合，于95℃加熱10min。樣品進行SDS－PAGE電泳分析，觀察肌原纖維蛋白的降解情況。

2 結果與討論

2.1 組織蛋白酶B的分離純化

樣品經(jīng)過預處理和硫酸銨鹽析后，上樣于SPSepharose陽離子交換層析柱。由圖1(A)可知，目的蛋白吸附于SP－Sepharose層析柱，而大量的雜蛋白未被層析柱吸附，因此該層析柱能有效地將雜蛋白與目的蛋白分開。吸附部分的蛋白質(zhì)用含0～1mol/L NaCl的緩沖液進行線性洗脫，有2個水解Z－Phe－Arg－MCA的酶活峰被洗脫下來。其中，前者為組織蛋白酶B，后者為組織蛋白酶L。在底物特異方面，組織蛋白酶B與L有著明顯的區(qū)別，組織蛋白酶L只分解熒光底物Z－Phe－Arg－MCA，而組織蛋白酶B不僅水解Z－Phe－Arg－MCA，同是也分解Z－Arg－Arg－MCA熒光底物。因此，本研究的目的蛋白組織蛋白酶B約在0.2mol/L NaCl的鹽濃度下被洗脫下來。將活性峰超濾濃縮后上樣于Sephacryl S－200 HR凝膠過濾層析柱，結果如圖1(B)所示。對活性部分進行電泳分析，由SDS－PAGE電泳圖譜結果(圖2)可知純化得到分子量約為27ku左右的單一蛋白條帶。有研究結果表明，魚類肌肉中的組織蛋白酶B的分子量約為24～29ku，比組織蛋白酶L的分子量相對低。如花腹鯖魚為 28ku［9］，白腹鯖魚(Scomber japonicus)為23ku［13］。根據(jù)分子量和底物特異性的結果推測本研究純化得到的單一條帶為組織蛋白酶B。從藍圓鲹肌肉650g中可純化得到0.4mg組織蛋白酶B，得率約為3%，純化倍數(shù)為2619.3倍。

表1 藍圓鲹組織蛋白酶B的純化表Table 1 Summary of purification of cathepsin B from blue scad(Decapterus maruadsi)

圖1 藍圓鲹組織蛋白酶B純化柱層析圖Fig.1 Chromatographic purification of cathepsin B from blue scad(Decapterus maruadsi)

2.2 溫度和pH對酶活力的影響

圖2 藍圓鲹組織蛋白酶B純化過程的SDS－PAGE圖譜Fig.2 SDS－PAGE of cathespin B from blue scad (Decapterus maruadsi)in the purification processing

如圖3(A)所示，藍圓鲹肌肉中組織蛋白酶B的最適溫度為55℃。當溫度為20℃時，組織蛋白酶B僅表現(xiàn)出最適溫度時30%左右的酶活力;當溫度為70℃時，由于高溫引起的蛋白變性，組織蛋白酶B的活性下降很快，僅為最適溫度時的10%左右。該結果與Jiang等人［9］從鯖魚中分離出組織蛋白酶B的溫度性質(zhì)表現(xiàn)相似。

如圖3(B)所示，組織蛋白酶B的最適pH為5.5。當pH為4.0時，組織蛋白酶B酶活力相對較弱，僅有最適pH時50%的活性;當pH大于7.0時，組織蛋白酶B酶活性下降很快，直至pH8.0時，該酶幾乎不表現(xiàn)酶活力。鯖魚［9］和大馬哈魚(Oncorhynchus keta)［14］中都得到相似的結果。因此，魚糜經(jīng)過清水或者堿水漂洗后，組織蛋白酶B的活性有大部分的損失，但是仍然有部分的殘留［6］。由于魚糜凝膠劣化常常發(fā)生在55～60℃的溫度區(qū)域，組織蛋白酶B的最適溫度與該溫度區(qū)域一致，因此，推測殘留的組織蛋白酶B可能在該溫度下表現(xiàn)出一定的酶活力，從而促進肌原纖維蛋白的降解。

2.3 底物特異性研究

組織蛋白酶B對熒光底物的水解作用表現(xiàn)專一。如表2所示，其僅對組織蛋白酶底物中的Z－Phe－Arg－MCA和Z－Arg－Arg－MCA產(chǎn)生強烈分解，而對其他類型的熒光底物，包括胰蛋白酶類底物Boc－Glu－Arg－Arg－MCA、Boc－Leu－Arg－Arg－MCA和Boc－Phe－Ser－Arg－MCA、胰凝乳蛋白酶底物Suc－Ala－Ala－Pro－Arg－MCA和Suc－Leu－Leu－Val－Tyr－MCA以及氨肽酶和組織蛋白酶H的底物Arg－MCA都表現(xiàn)出不分解或者分解程度很低。

圖3 藍圓鲹組織蛋白酶B的最適溫度(A)和最適pH(B) Fig.3 Optimal temperature(A)and pH(B)of cathepsin B from blue scad(Decapterus maruadsi)

底物特異性是區(qū)別組織蛋白酶B與組織蛋白酶L的重要區(qū)別之一。2種組織蛋白酶對底物的水解作用都十分專一，只分解組織蛋白酶類的底物。但組織蛋白酶L僅分解在P2位為芳香族氨基酸殘基的Z－Phe－Arg－MCA熒光底物［15－16］，而組織蛋白酶B不僅對Z－Phe－Arg－MCA熒光底物有強烈的分解，對Z－Arg－Arg－MCA也有明顯的水解作用［9，13］。

表2 組織蛋白酶B的底物特異性Table 2 Substrate specificity of cathepsin B

2.4 不同抑制劑對酶活力的影響

蛋白酶抑制劑E－64、Leupeptin和Chymostatin對組織蛋白酶B有強烈的抑制效果。如表3所示。當E－64濃度為0.01mmol/L、Chymostatin和 Leupeptin濃度為0.1mmol/L時，幾乎可以完全抑制組織蛋白酶B的酶活力。Chymostatin和Leupeptin不僅是半胱氨酸蛋白酶抑制劑，同時也分別是胰凝乳蛋白酶和絲氨酸蛋白酶抑制劑。絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF對組織蛋白酶B沒有表現(xiàn)明顯的抑制作用。金屬蛋白酶抑制劑EDTA的濃度為20mmol/L時，對組織蛋白酶B有微弱的抑制，但當其濃度為5mmol/L時表現(xiàn)出部分激活的作用。EDTA是巰基活性劑，因此證明組織蛋白酶B是一種巰基蛋白酶，該結果與Masahiro等人［13］對白腹鯖魚的研究結果相似。

2.5 組織蛋白酶B對肌原纖維的作用

本實驗室之前的研究表明，藍圓鲹肌原纖維蛋白在55℃下自身降解較快［11］，難于判斷外加組織蛋白酶B對其降解的影響，因此選擇自身降解較慢的羅非魚肌原纖維為實驗原料更為合理。如圖4所示，組織蛋白酶B與羅非魚肌原纖維蛋白在55℃，pH5.5下反應，當反應時間為120min時，肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain，MHC)發(fā)生明顯的降解作用。當反應時間延長到300min時，MHC幾乎降解80%。相比于對MHC的降解，組織蛋白酶B對肌動蛋白和原肌球蛋白的作用并不明顯。因此，組織蛋白酶B較容易作用于MHC的降解，進而影響肌原纖維蛋白的結構穩(wěn)定。Jiang等人對鯖魚的組織蛋白酶B［9］的研究也指出，該蛋白酶對于鯖魚肌原纖維中的MHC的降解有明顯的促進作用［2］，與本研究的結果相似。

表3 抑制劑對組織蛋白酶B活力的影響Table 3 Effect of inhibitor on cathepsin B

圖4 藍圓鲹組織蛋白酶B對肌原纖維蛋白降解的影響Fig.4 Effect of cathepsin B from blue scad (Decapterus maruadsi)on degradation of myofibrillar proteins

據(jù)報道，魚糜的凝膠劣化常常發(fā)生在溫度55～60℃。因此，魚體中最適溫度為55～60℃的酶類應該受到更多的關注。組織蛋白酶B與L相似，其最適溫度為55℃［9，16］，該酶是一種熱穩(wěn)定的蛋白酶。在魚糜的生產(chǎn)過程中，魚肉通常在冰水或者低濃度的堿水中反復漂洗，去除肌漿中的蛋白酶及色素等其它物質(zhì)。組織蛋白酶B不僅是水溶性的蛋白酶，同時也是酸性蛋白酶。雖然經(jīng)過反復的漂洗，但是組織蛋白酶B仍不能完全被去除，李樹紅等人［6］的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過2次清水和1次鹽水漂洗后，鰱魚肌肉中的組織蛋白酶B殘留率為11.46%。這些殘留的組織蛋白酶B仍可能促進肌原纖維的降解。雖然眾多研究認為組織蛋白酶L在魚體肌原纖維的降解和魚糜凝膠劣化中起著重要的作用［16－17］，但是組織蛋白酶B與L的性質(zhì)相似，該酶在魚體中的作用也十分的重要。Jiang等人［2］研究鯖魚中的肌原纖維降解時，發(fā)現(xiàn)添加一定量的組織蛋白酶B時，對肌原纖維蛋白的降解有著明顯的促進作用，因此，認為組織蛋白酶B與肌原纖維蛋白的降解也有著密切的關系，該結論與本實驗的結果相似。盡管組織蛋白酶B在中性pH下對蛋白的分解作用比肌原纖維結合型絲氨酸蛋白酶［4－5］弱，但在其酶學最適條件下，對肌原纖維蛋白的分解，尤其是對MHC，有著明顯的促進作用。因此，在魚糜制品生產(chǎn)過程中，抑制殘留的組織蛋白酶B的活性，將有可能減少魚肉肌原纖維蛋白的降解作用，部分解決魚糜凝膠劣化的問題。

3 結論

從藍圓鲹肌肉中分離純化得到組織蛋白酶B，其分子量約為27ku，得率約為3%，純化倍數(shù)為2619.3倍。純化的組織蛋白酶B能夠被半胱氨酸蛋白酶抑制劑E－64、Leupeptin和Chymostatin強烈抑制。同時，低濃度的EDTA可以激活組織蛋白酶B的酶活力，推測組織蛋白酶B也是一種巰基蛋白酶。在溫度為55℃和pH5.5時，組織蛋白酶B表現(xiàn)最大的酶活力。在該條件下，組織蛋白酶B能夠促進肌原纖維蛋白的降解作用，尤其是肌球蛋白重鏈(MHC)的分解。

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Purification and characterization of cathepsin B from the skeletal muscle of blue scad(Decapterus maruadsi)

ZHONG Chan，SHEN Jian－dong，CAI Qiu－feng，WENG Wu－yin，CAO Min－jie*(College of Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China)

During the manufacturing process of surimi，the modori phenomenon was an important factor that affected the final quality of the products.According to current studies，cathepsin B in the lysosome played a significant role in the degradation of myofibillar proteins.Cathepsin B in the muscle of various species of fish had been investigated.However，cathepsin B in marine fish blue scad(Decapterus maruadsi)was infrequently reported.In the present study，cathepsin B was purified by ammonium sulfate precipitation and a series of column chromatographies.SDS－PAGE showed that the molecular mass of the purified enzyme was about 27ku.The optimal temperature and pH of the enzyme were 55℃ and 5.5，respectively.Cathepsin B was effectively inhibited by cysteine proteinase inhibitor E－64.Under optimal conditions，cathepsin B could promote the degradation of myofibrillar proteins.Therefore，cathepsin B might participate in not only degradation of myofibrillar proteins，but also modori at acidic pH range.

Decapterus maruadsi;cathepsin B;characterization;myofibrillar protein

TS201.2+5

A

1002－0306(2012)10－0108－05

2011－10－13 *通訊聯(lián)系人

鐘嬋(1986－)，女，碩士研究生，主要從事食品生物技術方面的研究。

國家自然科學基金(31071519);廈門市科技計劃項目(3502Z20111042)。