董汝晶，譙順彬，田 輝，張義明，羅 芳，陶希芹

(1.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550003; 2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550003; 3.貴州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550008)

藻類光生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)及應(yīng)用研究

董汝晶1，2，3，譙順彬3，*，田 輝1，2，張義明2，3，羅 芳3，陶希芹3

(1.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550003; 2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550003; 3.貴州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550008)

根據(jù)藻類的生長(zhǎng)特點(diǎn)設(shè)計(jì)了一個(gè)容積為10.0L的光生物反應(yīng)器，其長(zhǎng)×寬×高分別為320mm×80mm× 390mm。利用該反應(yīng)器進(jìn)行螺旋藻培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，采用響應(yīng)面法對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化研究，建立以藻體干重為響應(yīng)值，以光照強(qiáng)度、通氣量、培養(yǎng)時(shí)間和裝液量為自變量的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型。培養(yǎng)條件優(yōu)化后螺旋藻最終干重為1.298g/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的反應(yīng)器能很好地滿足藻類生長(zhǎng)，其培養(yǎng)產(chǎn)率也明顯提高。

光生物反應(yīng)器，螺旋藻，響應(yīng)面法，藻體干重

1 10.0L光生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)

1.1 反應(yīng)器的主體尺寸

反應(yīng)器容積為10.0L，采用氣升式作為循環(huán)動(dòng)力。為了減少占地、提高空間利用率，將反應(yīng)器形狀設(shè)計(jì)為垂直板式，由主體結(jié)構(gòu)、光照系統(tǒng)和氣體循環(huán)系統(tǒng)三部分組成。主體結(jié)構(gòu)要求長(zhǎng)、寬、高有合理的尺寸，其具體尺寸應(yīng)該以易于放大和方便操作為設(shè)計(jì)依據(jù)。增加高度可以減小占地面積，但同時(shí)也增加了培養(yǎng)液中的溶氧濃度，使氣液間氧的傳質(zhì)過(guò)剩，造成溶氧的過(guò)飽和，此外，需要消耗更大的氣流作為循環(huán)動(dòng)力，使操作維護(hù)更加復(fù)雜。增加寬度能降低高度，可又增加了占地面積，同時(shí)隨著培養(yǎng)液濃度的不斷提高，光照強(qiáng)度衰減越明顯，減少了光能的利用率［4－5］。根據(jù)上述設(shè)計(jì)思想，本研究設(shè)計(jì)的反應(yīng)器主要技術(shù)參數(shù)見表1。

表1 10.0L氣升式生物反應(yīng)器的主要技術(shù)參數(shù)Table 1 The major parameters of 10.0L air lift photo－bioreactor

1.2 反應(yīng)器的光照系統(tǒng)

藻類的光合作用離不開光能，無(wú)論實(shí)驗(yàn)室研究還是室外大規(guī)模養(yǎng)殖，光照都是其主要的限制因子之一。螺旋藻是研究和應(yīng)用比較廣泛的藻類之一，其最適光照強(qiáng)度到目前為止還沒(méi)有得到一致的認(rèn)可［6－7］。但當(dāng)光照強(qiáng)度低于2.0klx時(shí)，藻體生長(zhǎng)緩慢甚至停止生長(zhǎng)，而光照強(qiáng)度超過(guò)120klx時(shí)會(huì)使藻體受到傷害甚至死亡。除光照強(qiáng)度外，不同顏色的光質(zhì)對(duì)藻體的生長(zhǎng)、光合放氧以及胞內(nèi)物質(zhì)的含量也有影響［8］。在常用的5種顏色即紅、黃、綠、藍(lán)和白色的光質(zhì)中，光照強(qiáng)度較大時(shí)處于紅光下生長(zhǎng)最好，白光次之，綠光最差。綠光更有利于蛋白質(zhì)的積累，白光次之，紅光最差;藍(lán)光有利于氧的釋放，白光和紅光次之，黃光和綠光較低。此外，在藻體培養(yǎng)的過(guò)程中，關(guān)于光照周期也存在差異。殷春濤等［9］以鈍頂螺旋藻進(jìn)行了光周期實(shí)驗(yàn)對(duì)比，結(jié)果證明螺旋藻無(wú)光暗周期，處于黑暗階段時(shí)藻體完全停止生長(zhǎng);李樂(lè)農(nóng)等［10］以鈍頂螺旋藻為研究對(duì)象，每天光照時(shí)間分別為10、14和18h三個(gè)時(shí)間段，結(jié)果證明以光暗比為14∶10時(shí)對(duì)藻體生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)和葉綠素積累都是最好的。

在本反應(yīng)器中，使用數(shù)支12W的白色光質(zhì)日光燈作為光源，以對(duì)稱平行的方式布置在反應(yīng)器兩側(cè)，燈管與反應(yīng)器壁以及燈管之間的距離可根據(jù)要求進(jìn)行調(diào)節(jié)，24h不間斷連續(xù)光照，通過(guò)控制燈管數(shù)目來(lái)滿足適合藻體生長(zhǎng)的光照強(qiáng)度，采用照度計(jì)LUX－101直接測(cè)定，單位klx(千勒克司)。

1.3 反應(yīng)器的氣體循環(huán)系統(tǒng)

在藻類培養(yǎng)過(guò)程中，要求整個(gè)培養(yǎng)體系循環(huán)均勻，尤其要防止死角的形成，故在本反應(yīng)器中，氣體分布裝置布置在距反應(yīng)器底部以上1.0cm處的地方，采用向下通氣的方式以防止器壁出現(xiàn)死角，使培養(yǎng)液得到充分混合，且整個(gè)培養(yǎng)體系形成一個(gè)外循環(huán)系統(tǒng)。

氣體分布裝置孔徑大小直接關(guān)系到氣泡的大小，大氣泡的提升效果優(yōu)于小氣泡，且不利于氧的傳遞，但氣泡上升到液面時(shí)由于突然爆裂而產(chǎn)生強(qiáng)大的剪切力，對(duì)藻類破壞較大，使藻體細(xì)胞斷裂，甚至死亡，這種現(xiàn)象在培養(yǎng)螺旋藻時(shí)更加明顯;氣泡過(guò)小時(shí)又會(huì)提高氣液間氧的傳遞，增加培養(yǎng)液中的溶氧。本反應(yīng)器中設(shè)計(jì)氣體分布裝置時(shí)，在前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上(孔徑大于3.0mm時(shí)通氣效果極差)，孔徑選取1.0mm左右為宜，能將氣流分散成直徑約2.0mm小氣泡，小氣泡在培養(yǎng)液表面破裂時(shí)產(chǎn)生的剪切力不致過(guò)度破壞藻體細(xì)胞。用氣泵和流量計(jì)控制通氣量和培養(yǎng)液的循環(huán)速度。

1.4 其它結(jié)構(gòu)

除上述幾個(gè)主要系統(tǒng)外，還為反應(yīng)器布置了溫控系統(tǒng)，用加熱裝置和溫控裝置可以快速加熱和準(zhǔn)確的控制培養(yǎng)溫度，以滿足藻類生長(zhǎng)需要。反應(yīng)器的主體采用玻璃制成，培養(yǎng)前可高溫滅菌。圖1是本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一組(4套)反應(yīng)器，該反應(yīng)器具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、價(jià)廉實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。

圖1 系列光生物反應(yīng)器的俯視圖和主視圖Fig.1 The planform and front view of a series vertical plate photo－bioreactor

2 螺旋藻培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證所設(shè)計(jì)的反應(yīng)器是否適合藻體生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)以該反應(yīng)器作為培養(yǎng)裝置培養(yǎng)鈍頂螺旋藻。

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)藻種 鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis) fachb－130，由武漢水生生物研究所提供;培養(yǎng)基 采用Zarrouk培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基［6］。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)在溫度和pH一定的條件下(溫度維持在(30±1)℃、pH維持在(9.50±0.01)，考察光照強(qiáng)度、通氣量、培養(yǎng)時(shí)間和裝液量對(duì)藻體生長(zhǎng)的影響，藻體干重(DW)的大小可表示藻體生長(zhǎng)的情況。在未滅菌的情況下，新鮮藻泥按0.1g/L的量接入反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)(前期實(shí)驗(yàn)表明以0.1g/L接入藻泥時(shí)平均比生長(zhǎng)速率最大)。實(shí)驗(yàn)以藻體干重為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，研究光照強(qiáng)度、通氣量、培養(yǎng)時(shí)間和裝液量對(duì)藻體生長(zhǎng)的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)由Design Expert(Version 7.0.2，Stat－Ease Inc;Minneapolis，MN.USA)軟件設(shè)計(jì)，選取響應(yīng)面法對(duì)上述四個(gè)因子的最佳水平范圍進(jìn)行優(yōu)化。各因子實(shí)驗(yàn)水平編碼分別為－α，－1，0，1，α，見表2。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中定時(shí)補(bǔ)加溫度相同的無(wú)菌水使培養(yǎng)體積保持恒定，減少測(cè)定誤差。

表2 中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因子水平及編碼表自變量水平編碼Table 2 Level and code variables for CCD

2.3 藻體生物量的測(cè)定

采用干重法(DW)［11］:取培養(yǎng)液20mL于已烘干至恒重的紙片抽濾，蒸餾水沖洗兩次，85℃烘干至恒重，用精密電子天平稱量，去除對(duì)照即得。

表4 DW二次模型的方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model DW

2.4 結(jié)果與分析

2.4.1 藻體干重二次多元模型的建立和顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)水平表2，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)包括4個(gè)因子，5個(gè)水平和6個(gè)中心重復(fù)，共30組實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果見表3。

表3 中心旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 CCD matrix of the variables and the actual and predicted values of DW

利用Design Expert對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行逐步回歸分析，并建立以藻體干重為響應(yīng)值的多元回歸模型，如下式所示:

Y=1.25+0.096A+0.0048B+0.039C－0.0098D +0.000313AB－0.018AC+0.0017AD+0.000063BC+ 0.00056BD+0.000438CD－0.1A2－0.057B2－0.024C2－0.033D2

其中，藻體干重為預(yù)測(cè)值，A、B、C、D分別為光照強(qiáng)度、通氣量、培養(yǎng)時(shí)間和裝液量的編碼值。

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。其中F＞F0.01(14，15)=3.56，P＜0.0001，說(shuō)明該模型概率在α =0.01水平上差異顯著，模型復(fù)相關(guān)系數(shù) R2= 0.9851，說(shuō)明藻體干重的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間具有很好的擬合度;其校正決定系數(shù)R2Adj=0.9712，表明有約3.0%的藻體干重總量變異不能由該模型進(jìn)行解釋。利用mathematica對(duì)上式求導(dǎo)，可知當(dāng)光照強(qiáng)度、通氣量、培養(yǎng)時(shí)間和裝液量分別取最佳水平4.4klx、212.2L/h、8.8d和7.2L時(shí)，藻體干重最大預(yù)測(cè)值為1.277g/L?；貧w分析結(jié)果還顯示，4個(gè)因子對(duì)藻體生長(zhǎng)的影響大小依次為光照強(qiáng)度＞培養(yǎng)時(shí)間＞裝液量＞通氣量，光照強(qiáng)度和培養(yǎng)時(shí)間的影響非常顯著(P＜0.0001)，而通氣量對(duì)藻體生長(zhǎng)影響較小;只有光照強(qiáng)度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)藻體干重的交互作用顯著(P＜0.0001)，而其它兩兩交互作用皆不顯著。

2.4.2 藻體干重模型驗(yàn)證 為了驗(yàn)證所建立的藻體干重模型是否具有實(shí)際意義，在優(yōu)化的因子水平范圍內(nèi)選擇性地進(jìn)行了4組實(shí)驗(yàn)，各因子水平見表5。

表5 模型驗(yàn)證Table 5 Model validation experiments

利用 SPSS11.5(Statistical Package for Social Sciences，SPSS)軟件對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析得知，藻體干重實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)系數(shù)R2=0.954，證明該模型具有一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。

2.4.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化后藻體的生長(zhǎng)情況 培養(yǎng)條件優(yōu)化后，即光照強(qiáng)度、裝液量和通氣量取最佳水平時(shí)，將培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至14d，每天定時(shí)取樣測(cè)藻體干重，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液的pH，以藻體干重和pH對(duì)培養(yǎng)時(shí)間作圖，如圖2所示。

從圖2可以看出，當(dāng)培養(yǎng)液pH超過(guò)10.17后藻體生長(zhǎng)達(dá)到平衡，且藻體干重達(dá)到1.298g/L。

3 結(jié)論

采用光合自養(yǎng)法培養(yǎng)螺旋藻對(duì)所設(shè)計(jì)的反應(yīng)器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并首次利用響應(yīng)面法對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)選取影響藻體生長(zhǎng)的4個(gè)因子(即光照強(qiáng)度、培養(yǎng)時(shí)間、裝液量和通氣量)為研究對(duì)象，對(duì)其最佳水平范圍進(jìn)行了優(yōu)化，并建立以藻體干重為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，當(dāng)上述因子取最佳水平時(shí)，藻體干重最大預(yù)測(cè)值為1.277g/L。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的反應(yīng)器能很好地滿足螺旋藻的生長(zhǎng)，提高螺旋藻培養(yǎng)產(chǎn)率。同時(shí)，該反應(yīng)器具有價(jià)格低廉、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，響應(yīng)面法優(yōu)化藻體培養(yǎng)條件過(guò)程新穎、科學(xué)，所建立的模型具有較好的實(shí)際指導(dǎo)意義。

圖2 培養(yǎng)條件優(yōu)化后螺旋藻的生長(zhǎng)曲線培養(yǎng)液的pH變化曲線Fig.2 The growth curve of DW and the variation of pH after optimization cultivation condition

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Design of photo－bioreactor and the application for cultivating algae

DONG Ru－jing1，2，3，QIAO Shun－bin3，*，TIAN Hui1，2，ZHANG Yi－ming2，3，LUO Fang3，TAO Xi－qin3
(1.School of Chemistry and Chemical Engineering of Guizhou University，Guiyang 550003，China; 2.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy，Guiyang 550003，China; 3.Guizhou Industry Polytechnic College，Guiyang 550008，China)

A new photo－bioreactor was designed basing on the growth trait of the algae.The volume of the reactor was 10.0L，the length，width and height was 320，80，390mm，respectively.Used the reactor to culture Spirulina platensis，and employed the response surface methodology to optimize the fermentation conditions.Then，researched the optimization concentration levels and the relations between these factors and building up a quadratic regression equation with dry weight as the dependent，light intensity，air flow，time of cultivation and volume of medium as independent.Under the optimistically conditions，the final dry weight was 1.298g/L.According to the experiment results，the photo－bioreactor designed was fit to cultivate the algae.

photo－bioreactor;Spirulina platensis;response surface methodology;dry weight

TS206

A

1002－0306(2012)10－0306－04

光生物反應(yīng)器(photo bioreactor)是專門用于光合生物或具有光合能力的組織培養(yǎng)的一類裝置，除具有普通生物反應(yīng)器的基本結(jié)構(gòu)外，還具有光照系統(tǒng)。一般植物的光能利用率約為0.2%左右，而設(shè)計(jì)合理的光生物反應(yīng)器的光能利用率可達(dá)到18.0%，較高的光能利用率有利于促進(jìn)光合生物的生長(zhǎng)，提高其培養(yǎng)產(chǎn)率，但光照過(guò)強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致光合生物生長(zhǎng)停止，甚至死亡，造成培養(yǎng)損失［1－2］。藻類是生長(zhǎng)最快的光合生物［3］，培養(yǎng)時(shí)通常采用氣升式光生物反應(yīng)器，這種反應(yīng)器用氣流提供循環(huán)動(dòng)力，能避免產(chǎn)生強(qiáng)大的剪切力而破壞光合生物細(xì)胞。藻類進(jìn)行光合作用會(huì)放出氧氣，當(dāng)培養(yǎng)液中溶解氧過(guò)飽和時(shí)，抑制藻類的光合作用，不利于藻體的生長(zhǎng)。因此，溶解氧的消除也是藻類培養(yǎng)時(shí)必須考慮的重要因素。本研究從降低螺旋藻生產(chǎn)成本的角度出發(fā)，旨在設(shè)計(jì)一套不但適合于螺旋藻開放式培養(yǎng)，而且兼具價(jià)格低廉、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便的氣升式光生物反應(yīng)器。在此基礎(chǔ)上，采用光合自養(yǎng)法培養(yǎng)螺旋藻對(duì)所設(shè)計(jì)的反應(yīng)器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并利用響應(yīng)面法對(duì)其培養(yǎng)條件最佳水平范圍進(jìn)行優(yōu)化研究。

2011－09－22 *通訊聯(lián)系人

董汝晶(1981－)，女，碩士，講師，研究方向:應(yīng)用微生物。

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(黔科合J字【2010】2068號(hào));國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30460039)。