藍(lán)蔚青，謝 晶

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306)

傳統(tǒng)生理生化鑒定技術(shù)結(jié)合PCR法分析復(fù)合保鮮劑對(duì)冷藏帶魚(yú)貯藏期間菌相變化的影響

藍(lán)蔚青，謝 晶*

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306)

將微生物傳統(tǒng)生理生化鑒定技術(shù)與PCR法相結(jié)合，研究了復(fù)合保鮮劑對(duì)冷藏帶魚(yú)貯藏期間菌相變化的影響。通過(guò)對(duì)冷藏對(duì)照組與保鮮劑處理組樣品貯藏期間的主要微生物進(jìn)行分離純化、16S rDNA序列分析與生理生化鑒定，并作系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，最終鑒定出13株具有典型特征的純菌株。對(duì)照組樣品在貨架期終點(diǎn)時(shí)，其主要微生物的種類與所占比例依次為:腐敗希瓦氏菌(34.7%)、熒光假單胞菌(14.5%)、松鼠葡萄球菌(10.2%)、嗜水氣單胞菌(8.2%)、弧菌(6.1%)、惡臭假單胞菌(6.1%)、綠色氣球菌(4.1%)、金黃色葡萄球菌(4.1%)、蠟樣芽孢桿菌(4.0%)、銅綠假單胞菌(2.0%)、嗜冷桿菌(2.0%)、成團(tuán)腸桿菌(2.0%)、約氏不動(dòng)桿菌(2.0%)。其中，腐敗希瓦氏菌為特定優(yōu)勢(shì)腐敗微生物。假單胞菌屬在帶魚(yú)冷藏過(guò)程中所占比例大小依次為熒光假單胞菌＞惡臭假單胞菌＞銅綠假單胞菌。經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理后，能夠使冷藏帶魚(yú)的二級(jí)鮮度貨架期延長(zhǎng)9d，并使其貯藏期間的細(xì)菌菌相組成比例發(fā)生變化，細(xì)菌種類減少到9種。主要優(yōu)勢(shì)菌的比例明顯減少，表明復(fù)合保鮮劑對(duì)帶魚(yú)體內(nèi)腐敗菌具有不同程度的抑制作用。

帶魚(yú)，復(fù)合生物保鮮劑，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，生理生化鑒定，菌相變化

水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)主要由微生物的作用影響造成，微生物的生長(zhǎng)活動(dòng)決定了水產(chǎn)品質(zhì)量的變化，因此對(duì)水產(chǎn)品貯藏過(guò)程中細(xì)菌菌相變化的研究將有助于對(duì)水產(chǎn)品貨架期進(jìn)行預(yù)測(cè)，為水產(chǎn)品保藏技術(shù)的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)［1－2］。帶魚(yú)(Trichiurus haumela)又稱裙帶魚(yú)、海刀魚(yú)、白帶魚(yú)等，屬暖溫性近底層魚(yú)類，為我國(guó)四大經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，具有較高的商業(yè)價(jià)值。然而，其常溫下易腐敗，冷藏是目前應(yīng)用最廣泛、最有效的水產(chǎn)品保鮮方法之一，可有效抑制細(xì)菌的增殖速度。鮮魚(yú)在貯藏期間細(xì)菌種群不斷變化，某些細(xì)菌適應(yīng)此貯藏條件逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，并產(chǎn)生腐敗臭味和異味等代謝產(chǎn)物，這些細(xì)菌就是該產(chǎn)品的特定腐敗菌(Specific Spoilage Organism)［3］。由于各種細(xì)菌的腐敗能力及產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不同，造成對(duì)產(chǎn)品不同的腐敗作用，因此研究其腐敗過(guò)程不僅需要研究細(xì)菌數(shù)量的變化，而且還要了解細(xì)菌種類的變化［4］。過(guò)去幾十年里，國(guó)外學(xué)者對(duì)新鮮、冷藏過(guò)程和腐敗魚(yú)類的細(xì)菌學(xué)開(kāi)展過(guò)部分研究工作［5－7］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)也有少部分相關(guān)報(bào)道。裘迪紅［8］等通過(guò)生理生化鑒定法對(duì)梭子蟹冷藏期間體內(nèi)的腐敗菌菌相變化進(jìn)行了初步分析。劉壽春［9］等人分析了剛捕獲淡水養(yǎng)殖羅非魚(yú)體表不同部位和養(yǎng)殖池水的細(xì)菌菌相。郭全友［10］等從菌落和細(xì)胞形態(tài)、生理生化特征、細(xì)胞脂肪酸組成及同源性分析等方面確定了冷藏養(yǎng)殖大黃魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。楊憲時(shí)［11］等對(duì)羅非魚(yú)冷藏過(guò)程中的細(xì)菌種群變化進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，而對(duì)于復(fù)合保鮮劑對(duì)水產(chǎn)品貯藏期間的菌相變化研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用傳統(tǒng)的微生物分離純化技術(shù)與16S rDNA分子鑒定方法相結(jié)合，分別對(duì)復(fù)合保鮮劑處理組與冷藏對(duì)照組的帶魚(yú)樣品貯藏過(guò)程中的主要腐敗微生物進(jìn)行分離與快速鑒定，以揭示在低溫下水產(chǎn)品中主導(dǎo)腐敗微生物的菌相組成。研究結(jié)果將為進(jìn)一步闡明復(fù)合保鮮劑的抑菌機(jī)理和實(shí)現(xiàn)靶向抑制產(chǎn)品腐敗打下良好的基礎(chǔ)，也為開(kāi)發(fā)水產(chǎn)品微生物快速鑒定方法提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮帶魚(yú)(Trichiurus haumela) 上海市浦東新區(qū)蘆潮港碼頭水產(chǎn)市場(chǎng)，0.25～0.50kg/條，捕獲后立即在冰藏條件下當(dāng)日運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn);胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、NaCl上海市疾病預(yù)防控制中心;革蘭氏染液、芽孢染色液、微生物生理生化微量鑒定管 杭州天和生物制劑有限公司;dNTP Mixture、10×PCR Buffer、TaqDNA酶 日本TaKaRa BIO株式會(huì)社;引物27f、1492r、TAE電泳緩沖液(50×TAE)、Biospin細(xì)菌基因組DNA提取盒 生工生物工程(上海)有限公司;DNA純化試劑盒 北京天根生物工程有限公司;溴化已錠染色液(EB)，6×Loading Buffer，Marker:λDNA/Hind III，100bp DNA Ladder，瓊脂糖等。

THZ－82A型氣浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠;隔水式恒溫培養(yǎng)箱、DHG－9053A型電熱鼓風(fēng)干燥箱、DK－8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司;LDZX－75KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠;VS－1300L－U型標(biāo)準(zhǔn)超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司; MiniSpan Plue微型高速離心機(jī) 杭州奧盛儀器有限公司;TC－24/H(b)型基因擴(kuò)增儀 杭州博日科技有限公司;DYY－6C型電泳儀 北京市六一儀器廠; BagMixer VW 拍打式均質(zhì)器 France;電子顯微鏡ZEISS Scope A1.AXIO 上海永傲精密儀器有限公司;Disrupter genie(DNA混勻器)，UVP BioImaging Systems(凝膠成像系統(tǒng))，SANYO MLS－3750高壓滅菌鍋等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)合生物保鮮劑的配制與原料處理

1.2.1.1 復(fù)合生物保鮮劑的配制 殼聚糖用1.0%乙酸溶液溶解，依次加入溶菌酶和茶多酚，使其最終配比為殼聚糖10.0g/L、溶菌酶0.3g/L與茶多酚3.0g/L，提前30min配好后立即放入(4±1)℃的冰箱中備用。

1.2.1.2 原料處理 將帶魚(yú)洗凈，經(jīng)“三去”處理(去頭、去尾、去內(nèi)臟)，無(wú)菌操作切成6～7cm長(zhǎng)的魚(yú)段，隨機(jī)分組，作保鮮或?qū)φ帐褂?。處理時(shí)，將復(fù)合保鮮液涂膜于樣品表面，瀝干后依次放入PE保鮮袋，在(4±1)℃的冰箱中貯藏，以蒸餾水處理的帶魚(yú)段作為對(duì)照組。

1.2.1.3 菌落總數(shù)測(cè)定 采用有氧平板菌落計(jì)數(shù)法，按GBT 4789.2－2008國(guó)標(biāo)［12］規(guī)定，分別將對(duì)照組第1、3、5、8d與復(fù)合保鮮劑處理組第1、3、5、8、10、12、16d冷藏帶魚(yú)的樣品進(jìn)行處理。

1.2.2 菌株分離鑒定 通過(guò)純培養(yǎng)方法得到多個(gè)不同形態(tài)的單菌菌落，根據(jù)菌落外觀與菌體鏡檢形態(tài)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行初步分類，計(jì)算同一種菌落的個(gè)數(shù)。

1.2.2.1 菌落與細(xì)胞形態(tài)觀察 對(duì)分離純化得到的單菌菌落進(jìn)行形態(tài)觀察記錄與菌落計(jì)數(shù)，主要包括菌落大小、形態(tài)、顏色、質(zhì)地、菌落隆起度、邊緣結(jié)構(gòu)、表面形態(tài)、光澤度與透明度等，并結(jié)合革蘭氏染色與芽孢染色，觀察菌株個(gè)體形態(tài)，包括細(xì)胞形狀與細(xì)胞間的排列方式等，對(duì)細(xì)菌種類進(jìn)行初步分類，計(jì)算不同處理方式(即對(duì)照組與復(fù)合生物保鮮劑處理組)在不同貯藏時(shí)間的同一類菌落個(gè)數(shù)。挑選菌落數(shù)合適(30～300個(gè)菌落)的計(jì)數(shù)平板，隨機(jī)挑取包含不同種類的50個(gè)典型單一菌落，平板劃線法反復(fù)進(jìn)行分離純化3次，得到的純化菌株保存于試管斜面培養(yǎng)基上，以備鑒定。

1.2.2.2 分類保存 根據(jù)菌落特征和形態(tài)學(xué)特征，首先將兩種處理方式在不同貯藏時(shí)間挑選出來(lái)的菌株依次作好標(biāo)記，進(jìn)行分組歸類，再將各組菌株進(jìn)行純培養(yǎng)，重復(fù)以上比較。將菌落特征和形態(tài)學(xué)特征有差異的重新標(biāo)記分類，再進(jìn)行純培養(yǎng)，重復(fù)以上操作3次，分離得到純菌株，每一種純菌株作2組平行，記錄細(xì)菌的形態(tài)特征。

1.2.3 單細(xì)菌DNA提取與純化 將經(jīng)過(guò)反復(fù)分離純化，進(jìn)行初步生理生化鑒定得到的純菌株接種到TSB中。在37℃，170r/min的搖床中培養(yǎng)17h，取10mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌培養(yǎng)液，在4℃，10000r/min下離心15min，棄上清，將細(xì)菌－20℃保存，用于下一步提取DNA［13］。

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取純化菌株的DNA，同時(shí)增加了溶菌酶破壁，提取出的DNA編號(hào)后，置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增 以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，選用細(xì)菌通用引物，正向引物為27f，反向引物為1492r。

表1 冷藏帶魚(yú)貯藏期間的細(xì)菌特征分析Table 1 Analysis of the properties of bacteria on T.haumela during cold storage

正向引物 27f:5'－GAGAGTTTGATCCTGGC TCAG－3'

反向引物 1492r:5'－CTACGGCTACCTTG TTACGA－3'

PCR擴(kuò)增采用25.0μL體系，反應(yīng)條件為2.5μL 10×PCR buffer;2.5μL dNTP(含 Mg2+);0.3μL TaqDNA酶;1.0μL正向引物;1.0μL反向引物;1.0μL DNA模板;16.7μL ddH2O。PCR反應(yīng)步驟為:a.94℃熱啟動(dòng)5min;b.94℃預(yù)變性5min;c.94℃變性1min; d.57℃退火 1min;e.72℃ 復(fù)性 2min;f.72℃ 延伸10min;重復(fù)步驟c、d、e 25次。使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物約為1500bp。采用DNA純化試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，獲得的純化產(chǎn)物送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。

1.2.5 16S rDNA測(cè)序結(jié)果與生理生化鑒定比對(duì) 參照《伯杰手冊(cè)》［14］和東秀珠、蔡妙英編著的《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［15］對(duì)分類得到的純菌株進(jìn)行生理生化鑒定，主要包括:氧化酶、接觸酶、淀粉酶、O/F、尿素利用、丙二酸鹽利用、明膠液化、H2S實(shí)驗(yàn)與糖、醇類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等。

1.2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析 測(cè)序得到菌株部分長(zhǎng)度的16S rDNA序列(約1460bp)，將測(cè)序結(jié)果登陸NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，通過(guò)Blast程序與GenBank中的核酸序列進(jìn)行比對(duì)，從中選出相似性較高的序列，應(yīng)用Chromas version1.62和DNAMAN version6.0軟件進(jìn)行多重比較后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合保鮮劑處理后冷藏帶魚(yú)細(xì)菌總數(shù)的變化

參照鮮帶魚(yú)［16］與鮮海水魚(yú)［17］國(guó)標(biāo)規(guī)定，細(xì)菌總數(shù)≤4lgCFU/g為一級(jí)鮮度，4lgCFU/g＜細(xì)菌總數(shù)≤6lgCFU/g為二級(jí)鮮度。由圖1可知，在冷藏的第3d與第5d后，對(duì)照組冷藏帶魚(yú)的細(xì)菌總數(shù)已先后超過(guò)了一級(jí)與二級(jí)鮮度，在冷藏的第8d后，其細(xì)菌總數(shù)更達(dá)到8.75lgCFU/g，樣品已完全腐敗。而復(fù)合保鮮劑處理組在冷藏初期的細(xì)菌總數(shù)有所下降，其主要原因在于殼聚糖與溶菌酶本身具有抑菌與殺菌作用，到冷藏的第16d，細(xì)菌總數(shù)才超過(guò)二級(jí)鮮度標(biāo)準(zhǔn)?？梢?jiàn)，殼聚糖復(fù)合保鮮劑涂膜處理能很好的抑制微生物生長(zhǎng)繁殖，延緩帶魚(yú)的腐敗變質(zhì)。從菌落總數(shù)的數(shù)值變化程度和趨勢(shì)來(lái)看，符合帶魚(yú)在冷藏條件下的腐敗發(fā)展趨勢(shì)，分離純化所選的時(shí)間間隔具有代表性。

圖1 復(fù)合保鮮劑對(duì)冷藏帶魚(yú)貯藏期間細(xì)菌總數(shù)變化的影響Fig.1 Effect of CBFA on total viable counts of T.haumela during cold storage

2.2 冷藏帶魚(yú)的細(xì)菌菌落特征

采用稀釋平板分離法和劃線分離法，經(jīng)過(guò)3次以上的比較分組與歸類計(jì)數(shù)，一共從不同貯藏時(shí)間的對(duì)照組與復(fù)合保鮮劑處理組冷藏帶魚(yú)樣品中主要分離出13種典型菌，分別命名為X1、X2……X13，其菌落與細(xì)菌的基本特征見(jiàn)表1。

2.3 單菌落DNA的提取

對(duì)分離得到的13種未知菌株進(jìn)行單細(xì)菌DNA提取，并利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在23kb左右出現(xiàn)條帶，表明已獲得較為完整微生物基因組的DNA，圖2為13種主要代表性菌株的DNA電泳圖譜。

2.4 菌株的16S rDNA基因序列

通過(guò)引物27f和1492r對(duì)13株活化菌進(jìn)行16S全長(zhǎng)序列的PCR擴(kuò)增，均得到重復(fù)性好且穩(wěn)定、清晰的特異性條帶，片段大小為1500bp左右，電泳圖譜結(jié)果如圖3所示。

2.5 16S rDNA測(cè)序結(jié)果與生理生化鑒定比對(duì)

帶魚(yú)冷藏貨架期結(jié)束時(shí)，其菌相趨于簡(jiǎn)單，貯藏期間的主要優(yōu)勢(shì)菌為X1和X2兩種，通過(guò)對(duì)冷藏帶魚(yú)貯藏期間6種主要優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定，其各項(xiàng)生理生化指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 冷藏帶魚(yú)貯藏期間主要優(yōu)勢(shì)菌的生理生化特征Table 2 The physiology and biological test of T.haumela during cold storage

表3 主要優(yōu)勢(shì)菌X1與X2同源性較高的菌株分析Table 3 Analysis of high homologies of strains of X1and X2

圖213 種菌株的DNA電泳圖譜Fig.2 Electrophoretic analysis of DNA from thirteen samples

圖3 13種菌株的16S rDNA電泳圖譜Fig.3 Electrophoretic analysis of PCR amplification products of the 16S rDNA gene fragments from thirteen samples

參照GenBank比對(duì)的結(jié)果作相應(yīng)的生理生化實(shí)驗(yàn)(表2)，并依據(jù)主要的生理生化反應(yīng)和菌落特征，可判斷出X1為希瓦氏菌屬(Shewanella sp.)中的一種，X2與X3分別為假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)細(xì)菌，X4為嗜冷桿菌屬(Psychrobacter sp.)中的一種，X5為氣單胞菌屬(Aeromonas sp.)中的細(xì)菌，X10為葡萄球菌屬(Staphylococcus sp.)中的一種，其余7種菌均在PCR擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果比對(duì)的基礎(chǔ)上，結(jié)合生理生化鑒定加以鑒別得出其各自屬種。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

將13株分離細(xì)菌所獲得的16S rDNA序列提交NCBI，獲得它們?cè)贕enBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的臨時(shí)登錄號(hào)。通過(guò)BLAST軟件與GenBank中已發(fā)表的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較分析，選取同源性多數(shù)在99%以上的7個(gè)菌株進(jìn)行比較，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，根據(jù)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近判斷細(xì)菌種類。其中，分別對(duì)優(yōu)勢(shì)菌X1與X2作同源性搜索(見(jiàn)表3)，并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(見(jiàn)圖4)。

由圖4可見(jiàn)X1與希瓦氏菌(Shewanella sp.)的親緣關(guān)系較近，且 X1與腐敗希瓦氏菌(登錄號(hào): GU930786.1)在同一分支中，結(jié)合生理生化反應(yīng)可證明X1為腐敗希瓦氏菌。X2與假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)親緣關(guān)系較近，且與熒光假單胞菌(登錄號(hào):HQ874650.1)在同一分支中，結(jié)合生理生化反應(yīng)，可證明X2為假單胞菌屬中的熒光假單胞菌。對(duì)其余11種菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)并結(jié)合生理生化反應(yīng)結(jié)果，可得X3為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，X4為嗜冷桿菌(Psychrobacter sp.)，X5為嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，X6為弧菌(Vibrio rumoiensis)，X7為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，X8為 成 團(tuán) 腸 桿 菌 (Enterobacter agglomerans)，X9為約氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter johnsonii)，X10為葡萄球菌屬(Staphylococcus sp.)，X11為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，X12為綠色氣球菌(Aerococcusviridans)，X13為金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)。

表4 帶魚(yú)冷藏過(guò)程中細(xì)菌的組成比例(%)Table 4 Proportion of bacteria changes and composition of T.haumela during cold storage(%)

表5 復(fù)合保鮮劑處理組帶魚(yú)冷藏過(guò)程中細(xì)菌的組成比例(%)Table 5 Proportion of bacteria changes and composition of T.haumela with CBFA during cold storage(%)

圖4 基于16S rDNA序列同源性的X1與X2菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of the X1and X2strains based on the16S rDNA sequences

2.7 帶魚(yú)冷藏過(guò)程中的菌相組成及變化情況

根據(jù)對(duì)13種菌株的PCR擴(kuò)增測(cè)序與生理生化鑒定結(jié)果，分別對(duì)不同天次冷藏對(duì)照組與復(fù)合保鮮劑處理組的帶魚(yú)樣品，經(jīng)反復(fù)分離純化與比較分類的典型菌株進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算其各自所占比例，帶魚(yú)冷藏過(guò)程中細(xì)菌組成及其變化情況見(jiàn)表4與表5。

由表4與表5可知，兩組帶魚(yú)樣品在貨架期終點(diǎn)時(shí)均為革蘭氏陰性菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，這一結(jié)果與Hubbs［18］的研究一致。與對(duì)照組相比，經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理后，冷藏帶魚(yú)的細(xì)菌菌相有明顯變化:第一，細(xì)菌的種類數(shù)量有所減少，隨著貨架期的結(jié)束，復(fù)合保鮮劑處理組的主要腐敗菌種類由原來(lái)的13種減少到9種，其中嗜冷桿菌(Psychrobacter sp.)、綠色氣球菌(Aerococcus viridans)在貯藏的第5d未檢出，成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans)在冷藏的第12d未檢出，金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)在冷藏的第14d未檢出;第二，革蘭氏陰性菌的比例有所增加，在冷藏的第8d，處理組的82.1%高于對(duì)照組的77.6%，在冷藏的第16d時(shí)增加到88.4%;第三，優(yōu)勢(shì)腐敗菌種類不變，仍為腐敗希瓦氏菌與熒光假單胞菌，但冷藏帶魚(yú)經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理后，其所占比例明顯減少。

3 結(jié)論

帶魚(yú)冷藏過(guò)程中，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其細(xì)菌種類趨于穩(wěn)定?；?6S rDNA的分子生物學(xué)方法對(duì)細(xì)菌種類進(jìn)行鑒定與傳統(tǒng)的生理生化反應(yīng)鑒定方法有較好的一致性。在冷藏貨架期結(jié)束時(shí)，帶魚(yú)的主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌為腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)與 熒 光 假 單 胞 菌 (Pseudomonas fluorescens)。腐敗希瓦氏菌大量存在于水和土壤中，水產(chǎn)品攜帶較多，此前也將希瓦氏菌屬歸類到假單胞菌屬，被稱為腐敗交替假單胞菌。Gill［19－20］等人研究認(rèn)為假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)和希瓦氏菌屬(Shewanella sp.)是冷鏈流通中高水分蛋白食品的特定腐敗菌SSO(Specific spoilage organisms)。貯藏過(guò)程中腐敗希瓦氏菌會(huì)產(chǎn)生H2S和不良?xì)馕?，同時(shí)導(dǎo)致肉變色、發(fā)粘，這可能是帶魚(yú)腐敗的一個(gè)主要原因。熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)為假單胞菌科假單胞菌屬桿菌，不產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色呈陰性，其廣泛分布于自然界，如土壤、水、植物及動(dòng)物活動(dòng)環(huán)境中。假單胞菌也是水產(chǎn)動(dòng)物常見(jiàn)的腐敗菌，在帶魚(yú)冷藏過(guò)程中其數(shù)量變化不大，但仍占一定比例，其中冷藏帶魚(yú)中的假單胞菌所占比例大小依次為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)＞惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)＞銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

本研究結(jié)合細(xì)菌的生理生化反應(yīng)和16S rDNA序列比對(duì)的方法，初步鑒定了帶魚(yú)在冷藏過(guò)程中的細(xì)菌組成，并與對(duì)復(fù)合保鮮劑處理組的細(xì)菌組成比例進(jìn)行比較，為今后研究復(fù)合保鮮劑的抑菌機(jī)理指明了方向。

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Effect of complex biological fresh－keeping agents for the main bacteria composition on cutlassfish Trichiurus haumela under the cold storage by PCR and physiology－biochemistry technology

LAN Wei－qing，XIE Jing*
(College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai Engineering Research Center of Aqhatic－product Processing＆Preservation，Shanghai 201306，China)

Microbial physiology－biochemistry technology in traditional method combined with PCR technology were used to study the effect of Complex Biological Fresh－keeping Agents(CBFA)on Trichiurus haumela.After the separation and purification of pre－dominate spoilage bacteria on Trichiurus haumela used by CBFA under the cold storage，16S rDNA sequence analysis，morphological and biochemical tests were used to identify the composition of spoilage microflora，and phylogenetic tree were analyzed.The result showed that there were mainly 13 typical bacterial strains of the controlled，and their proportions at the end of shelf life in control groups were:Shewanella putrefaciens 34.7%，Pseudomonas fluorescens 14.5%，Staphylococcus sciuri 10.2%，Aeromonas hydrophila 8.2%，Vibrio rumoiensis 6.1%，Pseudomonas putida 6.1%，Aerococcus viridans 4.1%，Staphyloccocus aureus 4.1%，Bacillus cereus 4.0%，Pseudomonas aeruginosa 2.0%，Psychrobacter sp.2.0% Enterobacter agglomerans 2.0% and Acinetobacter johnsonii 2.0%respectively.Among them，Shewanella putrefaciens(34.7%)was the Specific Spoilage Organism(SSO)，the proportion of Pseudomonas sp.in descending order was Pseudomonas fluorescens＞Pseudomonas putida＞Pseudomonas aeruginosa.It was found that the dominant spoilage bacteria of Trichiurus haumela was extended 9d by CBFA，the spoilage microflora was also changed，and the species of bacteria decreased to 9 strains.CBFA showed different inhibitory activity on different spoilage bacteria.

Trichiurus haumela;complex biological fresh－keeping agents(CBFA);polymerase chain reaction (PCR);physiology－biochemistry technology;microflora changes

TS254.4

A

1002－0306(2012)10－0330－06

2011－07－01 *通訊聯(lián)系人

藍(lán)蔚青(1977－)，男，工學(xué)博士，助理研究員，研究方向:食品冷凍冷藏工程。

“十二五”國(guó)家支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD38B09);上海市科委工程中心建設(shè)(11DZ2280300);上海海洋大學(xué)博士啟動(dòng)基金(A－2400－11－0202);上海市教育委員會(huì)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助(J50704)。