林 仁 王 瑋 朱元貴 趙小貞△

1（福建醫(yī)科大學 人體解剖學與組織胚胎學系，福州 350122）

2（福建醫(yī)科大學 附屬協(xié)和醫(yī)院老年病研究所，福州 350001）

阿爾茨海默病是常見的中樞神經(jīng)退行性疾病，老年斑是其的重要病理征之一［1－3］。本實驗采用七月齡雌性轉(zhuǎn)基因小鼠模型，分別應用Aβ免疫組織化學染色法與改良Bielshowsky鍍銀染色法觀察小鼠大腦皮質(zhì)第一運動區(qū)（primary motor cortex，M1）、大腦皮質(zhì)第二運動區(qū)（secondary motor cortex，M2）、齒狀回（gyrus dentatus，GD）、海馬CA1區(qū)（field CA1of hippocampus，CA1）、海馬CA3 區(qū)（field CA3of hippocampus，CA3），尾殼核（caudate putamen nucleus，CPu）以及小腦（cerebellum，Cb）等七個腦區(qū)老年斑的分布，以期探討二種方法檢測老年斑的可靠性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

七月齡阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因雌性小鼠7只（體質(zhì)量：40±3g，由美國Mary Jo Ladu教授惠贈），其中野生型小鼠3只，突變型4只。

1.2 Morris水迷宮檢測學習記憶能力

實驗歷時6天，記錄從進入水中到找到平臺的時間定為逃避潛伏期，取四個象限逃避潛伏期均值作為平均逃避潛伏期，進入水中后搜索平臺的路徑定為搜索策略。

1.3 實驗鼠處理

小鼠經(jīng)灌注取腦、石蠟包埋，進行5μm 與10 μm 交替連續(xù)冠狀切片，10張5μm 和5張10μm 計為一個模塊，共3模塊。5μm 切片備做酶免疫組織化學染色，10μm 切片備做改良Bielshowsky鍍銀染色。

1.4 酶免疫組織化學染色

具體步驟參照邁新生物科技公司UltraSensitiveTM S－P超敏試劑盒說明書。一抗：兔抗Aβ（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），加PBS 1∶400稀釋。陰性片以PBS代替一抗。

1.5 改良Bielshowsky鍍銀染色

切片常規(guī)脫蠟脫水，經(jīng)3%硝酸銀水溶液、10%甲醛水溶液、氨銀乙醇液、8%甲醛水溶液后5%硫代硫酸鈉液固定，脫水透明，中性樹膠封片。

1.6 體視學計量

應用每小格1.5×1.5的測試網(wǎng)格計數(shù)陽性物數(shù)量。

1.7 統(tǒng)計應用

SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件包，秩和檢驗分析改良Bielshowsky鍍銀染色與Aβ酶免疫組織化學染色的老年斑計數(shù)，并分析二者計數(shù)結(jié)果的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮實驗結(jié)果

秩和檢驗結(jié)果顯示，野生型小鼠和突變型小鼠小鼠平均逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；卡方檢驗分析小鼠的搜索策略，結(jié)果顯示兩組的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1）。

表1 野生型小鼠與突變型小鼠搜索策略的比較Table 1 Comparison of search strategy between wild type mice and mutant

2.2 Aβ酶免疫組織化學染色結(jié)果

AD 轉(zhuǎn)基因小鼠不同腦區(qū)均可見棕黃色均質(zhì)狀物的細胞質(zhì)中，且在突變型小鼠的M1、M2、CA1、CA3、GD、CPu的細胞外聚積成大小不一的棕黃色老年斑（見圖1）。統(tǒng)計分析顯示，Aβ在突變型小鼠與野生型小鼠腦內(nèi)的分布差異有統(tǒng)計學意義（MWU＝6361，P＜0.05）。在M1、M2、CA1、CA3、GD 及CPu腦區(qū)，野生型與突變型小鼠Aβ的分布差異有統(tǒng)計學意義（見表2）。但在Cb中，兩組的表達差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 Aβ免疫反應陽性物在阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠不同腦區(qū)的分布（Aβ免疫組織化學染色，×400）Fig 1 Immunohistochemical stains were positive for Aβin the different brain regions of AD transgenic mice

2.3 改良Bielshowsky鍍銀染色結(jié)果

除Cb外，突變型小鼠各腦區(qū)均可見類圓形的棕黑色斑塊，斑塊大小、數(shù)量不一。秩和檢驗分析顯示，棕黑色斑塊在突變型小鼠與野生型小鼠腦內(nèi)分布差異有統(tǒng)計學意義（MWU＝2597.5，P＜0.05）。其中，突變型小鼠M1、M2、CA1、CA3、GD 可見大量類圓形的棕黑色斑塊；而在Cpu僅少量出現(xiàn)，且斑塊較小。野生型小鼠M1、M2、CA1、CA3、GD 及Cpu只有少量不典型、體積較小的棕黑色類圓形斑塊出現(xiàn)（見圖2）。突變型小鼠和野生型小鼠在上述區(qū)域中均未發(fā)現(xiàn)典型神經(jīng)元纖維纏結(jié)。經(jīng)體視學計數(shù)后統(tǒng)計分析顯示，棕黑色斑塊在突變型小鼠與野生型小鼠的M1、M2、CA1、CA3、GD 及Cpu等相應腦區(qū)中的分布有差異有統(tǒng)計學意義（見表2）。

圖2 老年斑在阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的分布 改良Bielshowsky染色（bar＝50μm）Fig 2 The distribution of senile plaque in cerebral region of AD transgenic mice（bar＝50μm）

表2 突變型小鼠與野生型小鼠的相應腦區(qū)的老年斑及Aβ比較的MWU值Table 2 MWU value of the comparison of senile plaques and Aβin the different brain regions of wild－type mice and mutant type

2.4 Aβ與老年斑的相關(guān)性

經(jīng)相關(guān)性散點圖分析，Aβ免疫組化陽性反應物與改良Bielshowsky染色老年斑在阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)表達量可能存在相關(guān)性（見圖3）。經(jīng)相關(guān)分析結(jié)果顯示二者表達量呈正相關(guān)（r＝0.228，P＜0.01）。

圖3 改良Bielshowsky染色與Aβ免疫組織化學染色陽性物散點圖Fig.3 The scatter diagram shows correlation analysis results of Aβ immunohistochemistry and senile plaque

3 討論

阿爾茨海默病是一種以記憶力衰退、判斷力和理解力下降為主要表現(xiàn)神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病機制尚不清楚。為進一步探究其發(fā)病機制，研究者根據(jù)其發(fā)病機制假說，建立多種動物模型，如慢性缺血性癡呆模型、轉(zhuǎn)基因模型、膽堿能功能損傷模型等。模型建立的成功與否直接決定后續(xù)研究的成敗。老年斑與神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成是阿爾茨海默病的二個重要病理特征。Aβ聚積引起細胞外老年斑的形成，被認為在阿爾茨海默病的發(fā)病過程中起著核心作用［4］。此外，Aβ還促使Tau蛋白的磷酸化，后者是神經(jīng)纖維纏結(jié)的重要原因［5－6］。

已有臨床流行病學研究表明，AD 的發(fā)病具有明顯的性別差異，更年期后的女性AD 的患病率明顯升高［7］。本實驗采用七月齡雌性AD 轉(zhuǎn)基因小鼠，分別應用Morris水迷宮檢測學習記憶能力、應用改良Bielshowsky鍍銀染色法與Aβ免疫組織化學染色法檢測病理特征老年斑。Morris水迷宮檢測結(jié)果顯示，野生型小鼠的搜索策略較突變型小鼠好，提示未發(fā)生AD 的小鼠學習記憶能力強于AD小鼠。此外，本實驗發(fā)現(xiàn)野生型小鼠與突變型小鼠在平均逃避潛伏期無明顯差異，其原因可能是由于小鼠的運動能力存在差異（本實驗未對兩組小鼠進行運動能力檢測，對此感到遺憾）及本實驗的實驗小鼠數(shù)目較少引起的統(tǒng)計偏差有關(guān)。

改良Bielshowsky鍍銀染色法及Aβ酶免疫組織化學染色法檢測實驗小鼠腦內(nèi)老年斑或神經(jīng)纖維纏結(jié)的發(fā)生情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在突變型小鼠的腦內(nèi)均有大量陽性物出現(xiàn)，而野生型小鼠腦內(nèi)只偶見少數(shù)陽性物出現(xiàn)。其中，Aβ酶免疫組織化學染色結(jié)果可見野生型小鼠和突變型小鼠腦的細胞質(zhì)內(nèi)有均質(zhì)狀Aβ分布，且在突變型小鼠腦內(nèi)可見Aβ聚積形成類圓形棕黃色斑塊，斑塊分布廣泛，大小不一。改良Bielshowsky染色可見突變型小鼠腦內(nèi)有大量類圓形的棕黑色老年斑，老年斑大小不一，分布廣泛。經(jīng)統(tǒng)計分析顯示，老年斑在野生型小鼠與突變型小鼠腦的M1、M2、CA1、CA3、GD、Cpu區(qū)的分布存在差異。兩種染色方法均顯示老年斑在Cb中的分布差異無統(tǒng)計學意義。改良Bielshowsky染色的陽性反應物與Aβ酶免疫組織化學染陽性物經(jīng)體視學計數(shù)相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者呈正相關(guān)性。提示Bieshowsky染色結(jié)果與Aβ免疫組織化學染色結(jié)果一致。在由此可見，改良Bielshowsky銀染法和Aβ免疫組織化學染色法均可做為AD 模型可靠的檢測方法。當然，改良Bielshowsky鍍銀染色法和免疫組織化學法各有利弊，改良Bielshowsky鍍銀染色法在器械與容器的清潔方面要求較高，否則易產(chǎn)生假陽性或假陰性。但成功的改良Bielshowsky鍍銀染色結(jié)果能清晰觀察到典型老年斑的形態(tài)特征。且改良Bielshowsky鍍銀染色法具有穩(wěn)定性較好，敏感度高，重復性好等特點，可作為檢測老年斑的良好手段。Aβ免疫組織化學染色結(jié)果不但觀察免疫反應物的位置和形態(tài)，還具有針對性地反映了Aβ在阿爾茨海默病中的作用。但有出現(xiàn)假陽性的可能，因而必需同步設置陰性對照組、找出抗體的最佳稀釋比例、避免標本干燥以及注意將洗滌液沖洗干凈。

綜上所述，老年斑在AD 腦的海馬及軀體運動區(qū)等腦區(qū)均有廣泛分布，我們通過應用AD 轉(zhuǎn)基因小鼠證實了改良Bielshowsky鍍銀染色法與Aβ免疫組織化學染色法均可作為檢測AD 病理征老年斑的可靠方法，為后續(xù)實驗提供良好基礎(chǔ)。

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