謝韶瓊，陳 敏，萬慶華，宋 勛，汪青良，張玲琳

銀屑病因其發(fā)病率高，發(fā)病原因不明，長(zhǎng)期治療效果不理想，給患者身心健康帶來極大的痛苦[1]。臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，具有同一種疾病的不同患者對(duì)同一藥物的療效不一樣，而藥物效應(yīng)的個(gè)體化差異常常導(dǎo)致經(jīng)驗(yàn)用藥的失敗，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。阿維A是臨床上治療尋常性銀屑病的首選藥物[2,3]，但是，筆者在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，同是尋常性銀屑病患者，采用同樣劑量的阿維A系統(tǒng)治療，臨床療效和患者的不良反應(yīng)差異很大。國(guó)外已有學(xué)者對(duì)血管表皮生長(zhǎng)因子（VEGF）與藥物遺傳學(xué)相關(guān)性進(jìn)行了研究[4]。本研究擬采用藥物遺傳學(xué)研究方法，通過對(duì)患者基因單核苷酸多態(tài)性[VEGF-460(rs833061)，VEGF+405C(rs2010963)]的檢測(cè)分析，結(jié)合阿維A治療尋常性銀屑病的療效觀察，研究我國(guó)尋常性銀屑病患者系統(tǒng)用藥效應(yīng)基因多態(tài)性的特點(diǎn)，探討其與銀屑病病情及系統(tǒng)藥物治療的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例選擇 選取2010年3月～2011年9月在上海市皮膚病醫(yī)院住院的尋常性斑塊狀銀屑病患者105例。①診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照2002年國(guó)家藥品監(jiān)督管理局組織制定的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[5]中尋常性銀屑病的西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)。皮膚損害以紅色炎性丘疹、斑丘疹及大小不等的斑片為主，上覆多層銀白色鱗屑，刮去鱗屑可見一層光亮的薄膜，薄膜下可見點(diǎn)狀出血（Auspitz征）。②入選標(biāo)準(zhǔn)：符合尋常性銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇斑塊狀銀屑病患者，年齡16～80歲；不符合排除標(biāo)準(zhǔn)任意一項(xiàng)；治療前3個(gè)月內(nèi)未使用過維A酸、免疫抑制劑，未接受過光療、藥浴等治療；入選患者治療前銀屑病皮損面積嚴(yán)重度指數(shù)（PASI）評(píng)分10～12分；自愿參加本研究，能配合按期隨訪并簽署知情同意書者。③排除標(biāo)準(zhǔn)：并發(fā)嚴(yán)重的心、肝、肺、腎等內(nèi)臟疾病及高血脂患者；妊娠期、哺乳期婦女；對(duì)本試驗(yàn)藥物過敏者；治療期間隨意中止或更換治療藥物及方法者；關(guān)節(jié)性、膿皰性、紅皮病性銀屑病患者。

入選的105例患者中男79例，女26例，平均年齡（38.7±13. 9)歲，平均病程（6.5±3. 3)年。抽取每例患者的外周血4 ml備用。

1.1.2 主要儀器與試劑 PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀（加拿大BBI公司）；3730測(cè)序列分析儀（美國(guó) ABI 公司）；SW-CJ-1D潔凈工作臺(tái)（江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠）；DK-8D型電熱恒溫水槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海琪特分析儀器有限公司）；YXJ-2離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；H6-1微型電泳槽（上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（Gene Genius公司）；移液器（范圍：100～1 000 ml，20～200 ml，0.5～ 10 ml）（加拿大 BBI公司）。TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer(不含 Mg2+，其主要成分：100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.8，25℃；500 mmol/L KCl，0.8%（v/v）Nonidet）；MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（10 mmol/L）、Marker、6×DNA Loading Dye（生工生物工程有限公司）；PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒（生工生物工程有限公司，編號(hào)SK1141）；10×TAE（電泳緩沖液，成分：400 mmol/L Tris-acetate，10 mmol/L EDTA，pH8.0）。

1.2 方法

1.2.1 DNA抽提 不同基因型引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增：用上述酶和試劑抽提外周血DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。每例選用備選基因VEGF的2個(gè)位點(diǎn)（VEGF+405和VEGF-460），引物序列查自http://www.ncbi.nih.gov/unists，由上海生物工程有限公司合成，用應(yīng)用軟件Primer Premier 5（表1）。50 ml反應(yīng)體系中，第1輪模板1 ml，引物F 1 ml，引物R 1 ml，dNTP 10 mmol/L 1 ml，Taq Buffer 5 ml，25 mmol/L MgCl25 ml，Taq 酶0.5 ml，水35.5 ml；第2輪模板（第1輪PCR產(chǎn)物）0.2 ml，滅菌水36.3 ml，余同第1輪。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，3 min；變性94 ℃，30 s ；退火58 ℃，30 s ；延伸72 ℃，45 s；修復(fù)延伸，5 min；循環(huán)25次。

表1 不同基因型引物序列

1.2.2 電泳 1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA、20 min電泳觀察。

圖1 基因rs833061序列圖

圖2 基因rs2010963序列圖

1.2.3 測(cè)序 PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒（生工生物工程有限公司SK1141），F(xiàn)引物測(cè)序。檢測(cè)結(jié)果見圖1，圖2。

1.2.4 治療方法 給予每例患者阿維A 20～30 mg/d[0.4 mg/(kg·d)]，3個(gè)月后總結(jié)療效，治療前以及治療過程中每個(gè)月檢查肝、腎功能，血脂，血常規(guī)各1次。

1.2.5 療效評(píng)判 根據(jù)張長(zhǎng)宋等[6]的方法改良。治療前、后分別對(duì)患者進(jìn)行PASI評(píng)分，療效指數(shù)=（治療前PASI評(píng)分－治療后PASI評(píng)分）/ 治療前PASI評(píng)分×100%。痊愈：皮損全部消退，PAS1分值下降90%。顯效：皮損明顯消退，PAS1分值下降80%。有效：皮損部分消退，PAS1分值下降50%。無效：皮損消退不明顯，PAS1分值下降不足50%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS10.0軟件，率的比較采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 1%瓊脂糖電泳結(jié)果

基因rs833061和rs2010963擴(kuò)增條帶的大小分別為271 bp和172 bp（圖3，4）。

圖3 擴(kuò)增的rs833061條帶片段電泳圖，大小為271 bp

圖4 擴(kuò)增的rs2010963條帶片段電泳圖，大小為172 bp

2.2 尋常性銀屑病患者VEGF基因型分布情況

105例尋常性銀屑病患者中，1例因丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶偏高、1例因血脂過高、3例因皮膚黏膜干燥而退出本研究。每例選測(cè)2個(gè)位點(diǎn)（基因rs833061和基因rs2010963），其中基因rs833061C/C型10例（10%），rs833061T/T型 46例（46%），rs833061C/T型44例（44%）；基因rs2010963G/G型51例（51%），rs2010963C/G型33例（33%）, rs2010963C/C型16例（16%）（圖5）。

圖5 100例尋常性銀屑病患者VEGF基因型分布比例

2.3 阿維A治療不同基因型尋常性銀屑病患者的療效

治療前對(duì)不同基因型組的尋常性銀屑病患者進(jìn)行PASI評(píng)分，經(jīng)t檢驗(yàn)各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 基因rs833061C/T型尋常性銀屑病患者口服阿維A的有效率為 90.9%, rs833061C/C型患者有效率為70.0%，rs833061T/T型患者有效率為63.0%，基因rs833061C/T型患者的有效率與其他各型相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?；騬s2010963G/G型尋常性銀屑病患者口服阿維A有效率為70.6%,rs2010963C/G型患者有效率為69.7%, rs2010963C/C型患者有效率為68.7%，除rs833061C/T型外，其余各型之間的有效率相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 阿維A治療不同基因型尋常性銀屑病患者的療效對(duì)比 （例）

3 討論

阿維A是美國(guó)FDA批準(zhǔn)治療銀屑病3種一線藥物（甲氨蝶呤、阿維A、環(huán)孢素）中最安全的一種，是目前治療銀屑病的首選藥物。藥物遺傳學(xué)研究證明，藥物效應(yīng)基因多態(tài)性是確定不同患者產(chǎn)生不同療效和不良反應(yīng)的基礎(chǔ)。近年來，人類基因組計(jì)劃的完成為該現(xiàn)象做出了解釋：人類基因存在著大量的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，這是造成不同個(gè)體在相同環(huán)境中對(duì)疾病的易感性、對(duì)藥物的敏感性及不良反應(yīng)不同的原因[7,8]。此前，研究較多的是某些基因與銀屑病發(fā)病及病情的相關(guān)性，或者阿維A對(duì)銀屑病患者VEGF的影響[9,10]。國(guó)外有研究證明，阿維A治療尋常性銀屑病的臨床療效與患者VEGF不同基因型有很大的相關(guān)性，確定VEGF多態(tài)性和每例患者VEGF的標(biāo)志可以作為預(yù)測(cè)銀屑病治療反應(yīng)的手段[4]，但是目前沒有系統(tǒng)的臨床和實(shí)驗(yàn)研究。據(jù)此，本研究旨在通過對(duì)我國(guó)尋常性斑塊狀銀屑病患者血液VEGF多態(tài)性檢測(cè)，結(jié)合阿維A的療效，分析兩者的相關(guān)性，為今后臨床選藥、提高療效、減少藥物不良反應(yīng)提供借鑒，為進(jìn)一步的基因和藥物療效相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)。

隨著人類基因組計(jì)劃的完成和后基因組時(shí)代的到來，人們可以利用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)不同個(gè)體的藥物相關(guān)基因進(jìn)行解讀，臨床醫(yī)師可以根據(jù)患者的基因型資料實(shí)施給藥方案，并“量體裁衣”式地合理用藥，以提高療效和降低不良反應(yīng)，同時(shí)減輕患者的病痛和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。這種基因?qū)虻膫€(gè)體化用藥，代表著藥物基因組學(xué)與臨床遺傳學(xué)的完美結(jié)合，具有劃時(shí)代的意義。

本研究結(jié)果顯示，100例尋常性斑塊狀銀屑病患者有不同的VEGF基因型，采用阿維A 0.4 mg/(kg·d)治療3個(gè)月后，基因rs833061C/T型患者的治療效果最好。希望今后通過類似的更大樣本研究得出科學(xué)結(jié)論，通過快速單核苷酸多肽檢測(cè)，為阿維A治療尋常性銀屑病提供選擇性借鑒，提高其臨床療效，減少不良反應(yīng)。

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