楊桂蘭，田卓華，寧淑鵬，王佳媚，楊靈霞，邊 芳，王劍鋒， 郭建魁，哈小琴

中波紫外線(UVB)是誘導(dǎo)皮膚損傷和氧化應(yīng)激的主要環(huán)境因素之一，光老化、皮膚炎癥、皮膚腫瘤的發(fā)生與UVB慢性損傷密切相關(guān)[1]。甘草、紅景天、黃芪等天然藥物主要生長(zhǎng)于高原、高海拔地區(qū)，因其具有較好的藥用價(jià)值，自古以來被廣泛應(yīng)用，是中藥方劑的重要組成部分。甘草、紅景天、黃芪對(duì)紫外線慢性照射誘導(dǎo)皮膚損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制少見報(bào)道。本課題組既往的研究表明，甘草、紅景天、黃芪等水提物可上調(diào)UVB誘導(dǎo)的BALB/c小鼠皮膚中熱休克蛋白（HSP）27水平[2]。白細(xì)胞介素（IL）-10是一種抗炎性因子，參與免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞的生物調(diào)節(jié)[3]。筆者進(jìn)一步研究甘草、紅景天、黃芪對(duì)UVB誘導(dǎo)的BALB/c小鼠皮膚中IL-10水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

使用SH 4B型紫外線光療儀（上海希格瑪高技術(shù)有限公司），小鼠IL-10 ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。在蘭州市中藥材市場(chǎng)采購甘草、紅景天、黃芪各1 000 g，經(jīng)本院藥材科鑒定（符合中華人民共和國(guó)藥典規(guī)定），并協(xié)助提取制成相應(yīng)藥物的粗提物。在蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購買體重18 g左右的雌性BALB/c小鼠54只。

1.2 方法

采用隨機(jī)數(shù)字法將54只小鼠隨機(jī)分為9組（每組6只）：①正常對(duì)照組（不予處理），②UVB對(duì)照組（背部剃毛+UVB照射），③溶劑對(duì)照組（外涂蒸餾水+UVB照射），④UVB+5%甘草組（外涂5%甘草粗提物水溶液+UVB照射），⑤UVB +10%甘草組（外涂10%甘草粗提物水溶液+UVB照射），⑥UVB+5%紅景天組（外涂5%紅景天粗提物水溶液+UVB照射），⑦UVB+10%紅景天組（外涂10%紅景天粗提物水溶液+UVB照射），⑧UVB+5%黃芪組（外涂5%黃芪粗提物水溶液+UVB照射），⑨UVB+10%黃芪組（外涂10%黃芪粗提物水溶液+UVB照射）。.

于小鼠背部剃毛后根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案給予相應(yīng)藥物外涂（藥物粗提物水溶液給藥低劑量為5 mg/cm2、高劑量為10 mg/cm2）；UVB照射20 min，照射劑量為500 mJ/cm2，每日1次，連續(xù)1個(gè)月，照射總劑量為15 000 mJ/cm2。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用頸椎脫臼法處死小鼠，收集背部相應(yīng)部位皮膚組織，稱重、剪碎，按1:1比例加三蒸水勻漿， 離心10 000 r/min共5 min，取上清液-20℃保存?zhèn)錅y(cè)。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)皮膚組織勻漿液上清中IL-10含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.0軟件，單因素方差分析處理不同組間資料，數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蒸餾水對(duì)UVB照射小鼠皮膚IL-10水平的影響

外涂蒸餾水+UVB照射組小鼠背部皮膚中IL-10水平與單獨(dú)UVB照射組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示蒸餾水對(duì)UVB照射無明顯作用，各組藥物對(duì)IL-10的調(diào)節(jié)作用由藥物本身產(chǎn)生，與溶劑無關(guān)（表1，圖1）。

2.2 UVB照射對(duì)誘導(dǎo)小鼠皮膚IL-10水平的影響

UVB照射后小鼠背部皮膚中IL-10水平為（838.8±114.34）pg/ml，與對(duì)照組（568.45±78.8）pg/ml相比顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1，圖1）。

2.3 甘草、紅景天和黃芪粗提物水溶液對(duì)小鼠皮膚IL-10水平的影響

從表1和圖1可見甘草、紅景天和黃芪粗提物水溶液均可顯著上調(diào)IL-10水平，與UVB對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（甘草組P＜0.001，紅景天組與黃芪組P＜0.01），且甘草組IL-10水平較紅景天組與黃芪組顯著增高（P＜0.05）。但不同濃度對(duì)IL-10表達(dá)的干預(yù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 3種藥物粗提物水溶液對(duì)UVB誘導(dǎo)小鼠皮膚IL-10表達(dá)水平的影響 [±s , pg/ml]

表1 3種藥物粗提物水溶液對(duì)UVB誘導(dǎo)小鼠皮膚IL-10表達(dá)水平的影響 [±s , pg/ml]

注：與正常對(duì)照組相比，aP＜0.01；與UVB對(duì)照組相比， bP＞0.05；與UVB對(duì)照組相比，cP＜0.001；與UVB對(duì)照組相比，dP＜0.01；與紅景天組與黃芪組相比，eP＜0.05

組 別 IL-10水平正常對(duì)照組 568.45± 78.80 UVB對(duì)照組 838.80±114.34a溶劑對(duì)照組 826.85± 80.18b UVB+5%甘草組 1319.12±100.32ce UVB+10%甘草組 1256.22±169.62ce UVB+5%紅景天組 1046.07± 66.92d UVB+10%紅景天組 1083.62±117.02d UVB+5%黃芪組 1066.45±109.58d UVB+10%黃芪組 1052.90± 54.56d

圖1 3種藥物粗提物水溶液對(duì)UVB誘導(dǎo)小鼠皮膚IL-10表達(dá)水平的影響

3 討論

UVB主要作用于表皮，不僅導(dǎo)致皮膚曬黑、光老化，且與皮膚腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，是引起多種日光相關(guān)性皮膚病及皮膚腫瘤的重要環(huán)境因素[1]。

近年來，一方面隨著社會(huì)工業(yè)化的發(fā)展，臭氧層逐漸受到破壞，日光中紫外線對(duì)人類健康的威害日益嚴(yán)重；另一方面隨著人們生活水平的提高，人們保護(hù)皮膚健康的意識(shí)不斷提高，擁有健康皮膚的愿望越來越強(qiáng)烈。開發(fā)以天然藥物為主要成分的防紫外線外用制劑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

甘草、紅景天、黃芪等藥物的相關(guān)制劑已廣泛應(yīng)用于臨床，因其具有較好的調(diào)節(jié)免疫、抗炎及抗衰老作用[4-6]，近年來在抗紫外線方面開啟了探索性研究。初步研究結(jié)果顯示，甘草、紅景天、黃芪等水提物可有效保護(hù)UVB誘導(dǎo)的小鼠皮膚損傷[2]。紅景天苷在體外對(duì)紫外線誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[7]。黃芪醇提物灌胃對(duì)紫外線照射引起的無毛小鼠皮膚光老化具有保護(hù)作用[8]。但是，尚需大量的研究工作來闡明其抗紫外線的效果及其機(jī)制。

IL-10是一種具有較強(qiáng)的抗炎和免疫抑制活性的細(xì)胞因子，主要由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）分泌，是免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)的重要組成部分，是Treg發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要遞質(zhì)之一，對(duì)Th1型炎性細(xì)胞因子具有抑制作用，也可通過直接抑制Th細(xì)胞活性而起到免疫調(diào)節(jié)作用[9,10]。UVB可直接損傷細(xì)胞DNA，導(dǎo)致6-4環(huán)丁烷嘧啶二聚體的形成，在皮膚腫瘤的發(fā)生中起到重要作用。而DNA損傷可導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因如p53基因及細(xì)胞因子IL-10的合成受到影響，使細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，可通過調(diào)節(jié)IL-10的表達(dá)增強(qiáng)對(duì)紫外線的抵抗作用[11,12]。

本研究首先在BALB/c小鼠皮膚中研究了甘草、紅景天、黃芪粗提物水溶液對(duì)UVB照射誘導(dǎo)的小鼠皮膚組織中IL-10的影響，以探討其防御UVB損傷、保護(hù)皮膚的作用及其機(jī)制。研究結(jié)果表明，UVB照射可誘導(dǎo)皮膚組織中IL-10水平增高，提示小鼠皮膚在接受UVB照射后首先發(fā)生自我保護(hù)作用，產(chǎn)生一些保護(hù)性細(xì)胞因子，以防御進(jìn)一步的損傷。甘草、紅景天、黃芪等粗提物水溶液局部應(yīng)用可更進(jìn)一步促進(jìn)小鼠皮膚組織表達(dá)IL-10，其中以甘草組最為明顯，提示上述藥物具有一定的防UVB作用。其機(jī)制之一可能是通過誘導(dǎo)皮膚組織分泌IL-10實(shí)現(xiàn)的。然而，諸多細(xì)胞因子之間構(gòu)成一個(gè)龐大而復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，各種細(xì)胞因子的作用既相互獨(dú)立又彼此影響和聯(lián)系，因此尚需進(jìn)一步的研究來闡明上述藥物抗UVB的機(jī)制。

[1]楊桂蘭, 鄭家潤(rùn). 紫外線抑制免疫系統(tǒng)的研究進(jìn)展 [J]. 國(guó)際皮膚性病學(xué)雜志, 2006, 32(4):231-234.

[2]田卓華, 楊桂蘭, 杜華, 等. 甘草等粗提物對(duì)UVB誘導(dǎo)小鼠皮膚HSP27基因表達(dá)的影響 [J]. 中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志, 2010,26(3):164-16.

[3]李貞, 杜華, 張新玲, 等. 小檗堿衍生物HB-13對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌IL-10的影響 [J]. 中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志, 2010, 26(5):314-316.

[4]陳紅. 甘草藥理作用概述 [J]. 海峽藥學(xué), 2005, 17(4):37-41.

[5]馬根順, 羅丁. 紅景天藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥, 2009,42(8):227-228.

[6]吳發(fā)寶, 陳希元. 黃芪藥理作用研究綜述 [J]. 中藥材, 2004,27(3):232-234.

[7]史飛, 李鈾, 王毅俠, 等. 紅景天甙對(duì)經(jīng)UVA/UVB輻射的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響 [J]. 北京中醫(yī)藥, 2010, 29(8)627-631.

[8]王詩晗, 吳景東, 趙麗, 等. 黃芪醇提物抗紫外線誘導(dǎo)無毛小鼠皮膚光老化的作用研究 [J]. 實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志, 2011, 25(5):44-46.

[9]Cavani A. T regulatory cells in contact hypersensitivity [J]. Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2008, 8(4):294-298.

[10]Tonnel AB. Specific immunotherapy and therapeutic strategies in allergic diseases. What's new? [J]. Bull Acad Natl Med, 2005,189(7):1475-1487.

[11]Wang SQ, Balagula Y, Osterwalder U. Photoprotection: a review of the current and future technologies [J]. Dermatol Ther, 2010, 23(1):31-47.

[12]Beissert S, Loser K. Molecular and cellular mechanisms of photocarcinogenesis [J]. Photochem Photobiol, 2008, 84(1):29-34.