何瑋玲，黃 明，張 馳*

(1.南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 南京 210028；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

食品中肉類成分種屬鑒別技術(shù)研究進(jìn)展

何瑋玲1,2，黃 明2，張 馳1,*

(1.南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 南京 210028；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

肉與肉制品的摻雜、摻假是食品質(zhì)量控制面臨的重要挑戰(zhàn)。食品中肉類成分的鑒別與分析技術(shù)已逐步形成了分別以蛋白質(zhì)檢測(cè)和以核酸檢測(cè)為基礎(chǔ)的方法體系，其鑒別精度可達(dá)屬與亞屬水平，檢測(cè)靈敏度也達(dá)到了納克級(jí)。近年來(lái)，食品中肉類成分的定量檢測(cè)與溯源又成為了本領(lǐng)域中的新研究熱點(diǎn)。本文綜述食品中肉類成分種屬鑒別技術(shù)的研究進(jìn)展，并重點(diǎn)分析應(yīng)用熒光定量PCR對(duì)食品中肉類成分進(jìn)行定量分析的現(xiàn)狀與前景。

肉制品；摻假；種屬鑒別；定量

肉制品質(zhì)量安全是全社會(huì)共同關(guān)注的熱點(diǎn)話題。不法企業(yè)使用相對(duì)廉價(jià)的豬肉、雞肉等肉類原料，通過(guò)各種手段的深加工，冒充牛肉、羊肉制品進(jìn)行銷售以謀取不當(dāng)利益，這嚴(yán)重侵犯了消費(fèi)者的合法權(quán)益。在我國(guó)，假冒的牛羊肉卷已多次被媒體曝光；在西方，一項(xiàng)對(duì)近千種肉制品的檢測(cè)分析表明，有近20%的產(chǎn)品存在標(biāo)識(shí)與品種不完全相符的現(xiàn)象[1]。

傳統(tǒng)的依靠感官與經(jīng)驗(yàn)的肉類形態(tài)學(xué)鑒別手段已遠(yuǎn)不能滿足對(duì)上述肉制品摻假現(xiàn)象進(jìn)行控制與監(jiān)管的需要。近10多年來(lái)，應(yīng)用現(xiàn)代儀器分析與分子生物學(xué)方法對(duì)食品中肉類成分的鑒別技術(shù)不斷發(fā)展，鑒別精度與檢測(cè)靈敏度均極大提高，已逐步形成了分別以蛋白質(zhì)檢測(cè)和以核酸檢測(cè)為基礎(chǔ)的方法體系。近年來(lái)，熒光定量PCR(real-time PCR，RTi-PCR)技術(shù)的飛速發(fā)展又使得對(duì)深加工食品中肉類原料的定量與溯源成為可能。本文將分別綜述基于蛋白質(zhì)檢測(cè)與核酸檢測(cè)的食品中肉類成分鑒別技術(shù)，并特別分析應(yīng)用RTi-PCR對(duì)食品中肉類成分定量分析的現(xiàn)狀與問(wèn)題。

1 以蛋白質(zhì)檢測(cè)為基礎(chǔ)的肉類本質(zhì)鑒別技術(shù)

從20世紀(jì)90年代末至今，大量研究報(bào)道了應(yīng)用免疫學(xué)方法對(duì)食品中各種動(dòng)物源性成分的鑒定技術(shù)[2-5]，相應(yīng)的酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒與免疫層析試紙條也已面世[3,6]。在抗體方面，牛H-鈣調(diào)蛋白抗體是首先用于檢測(cè)食品與飼料中牛源性成分的種屬特異性抗體，但由于其對(duì)平滑肌以外的組織成分檢測(cè)靈敏度較低，因此反芻動(dòng)物肌鈣蛋白等不具組織特異性的特異性蛋白質(zhì)逐步取代了H-鈣調(diào)蛋白，成為了肉類本質(zhì)鑒別抗體技術(shù)開(kāi)發(fā)的理想靶標(biāo)[4]。商品化的ELISA試劑盒與免疫層析試紙條等免疫學(xué)鑒定技術(shù)具有檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)也存在著特異性較低、受樣品基質(zhì)影響大的局限。另外，肉制品中的特征蛋白質(zhì)會(huì)隨著不同加工條件而發(fā)生變性，因此需要針對(duì)不同變性程度的抗原設(shè)計(jì)特異性抗體，食品的加工程度極大地影響著免疫檢測(cè)試劑盒的選擇性與靈敏度[2-3]。目前，尚未有一種商品化的免疫種屬鑒定方法通過(guò)美國(guó)FDA或AOAC等權(quán)威機(jī)構(gòu)的認(rèn)證[4-6]。

除免疫學(xué)方法外，根據(jù)蛋白質(zhì)分布特征區(qū)分動(dòng)物種屬是食品中肉類本質(zhì)鑒別的另一思路。利用高效液相色譜(HPLC)法檢測(cè)肉制品提取物中組氨酸二肽、肌肽、鵝肌肽和鯨肌肽的分布特征，可有效地對(duì)反芻動(dòng)物來(lái)源的肉制品進(jìn)行鑒定[7]。此外，通過(guò)十二磺基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、毛細(xì)管凝膠電泳(CE)和等電聚焦電泳(IEF)等電泳技術(shù)對(duì)肉制品提取物中的蛋白質(zhì)分布特征進(jìn)行定性、定量分析，從而鑒別肉類的方法也屢見(jiàn)報(bào)道[8-9]。然而，肉制品中蛋白質(zhì)含量變化范圍廣、干擾因素多，導(dǎo)致此類技術(shù)靈敏度較低、易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)化與推廣應(yīng)用的前景均受到很大局限。

2 以核酸檢測(cè)為基礎(chǔ)對(duì)食品中肉類種屬的定性檢測(cè)

DNA的熱穩(wěn)定性與酸堿穩(wěn)定性均優(yōu)于蛋白質(zhì)，以動(dòng)物種屬間遺傳信息的差異作為物種鑒別的檢測(cè)靶點(diǎn)具有特異性高、方法便捷、不受組織類別限制等諸多優(yōu)勢(shì)，已逐漸成為食品中肉類成分鑒別的主流方法[1]。在目標(biāo)基因選擇方面，線粒體基因組DNA序列具有高度的物種特異性，且拷貝數(shù)多、在食品加工過(guò)程中降解程度低的優(yōu)點(diǎn)，因此其多態(tài)性位點(diǎn)是設(shè)計(jì)肉類本質(zhì)鑒定方法的首選靶點(diǎn)；此外，細(xì)胞基因組中的重復(fù)序列，包括微衛(wèi)星序列、短散布核元件(SINE)、端粒序列等也是用作物種鑒別的良好靶標(biāo)；而細(xì)胞基因組中的編碼序列由于為單一拷貝，食品加工過(guò)程中DNA部分降解后導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度降低，因此較不宜用于食品中肉類成分的鑒別[1]。

就技術(shù)角度而言，DNA探針雜交是最早用于食品中肉類成分鑒定的核酸檢測(cè)方法[10]。近十多年來(lái)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的迅速發(fā)展為物種鑒別開(kāi)辟的新了途徑，逐步成為了食品中肉類種屬鑒定的核心方法。其基本的實(shí)驗(yàn)思路為：根據(jù)不同物種細(xì)胞或線粒體基因組序列中的特征位點(diǎn)設(shè)計(jì)物種特異性引物，利用PCR反應(yīng)實(shí)現(xiàn)食品中目標(biāo)基因片段的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，繼而通過(guò)電泳或熒光檢測(cè)鑒別食品中可能的物種來(lái)源。自從Tartaglia等[11]首先報(bào)道了用PCR方法檢測(cè)飼料中的牛、羊源性成分至今，大量研究報(bào)道了應(yīng)用PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)的流程對(duì)食品中多種肉類本質(zhì)的鑒別方法[12-14]，其鑒定靈敏度較蛋白質(zhì)檢測(cè)及DNA雜交提高了1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，并實(shí)現(xiàn)了在同一PCR反應(yīng)體系里加入多對(duì)引物同時(shí)檢測(cè)牛、豬、驢、山羊、綿羊、禽類等多種肉類成分的多重PCR鑒定[12-13]，相應(yīng)的方法也已大量通過(guò)認(rèn)證，進(jìn)入國(guó)際、國(guó)內(nèi)的權(quán)威檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

食品中DNA成分復(fù)雜，加之PCR技術(shù)的高靈敏度，使得應(yīng)用PCR擴(kuò)增方法來(lái)鑒定物種具有因非特異性擴(kuò)增而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果的缺點(diǎn)。此外，對(duì)于未知基因序列的物種，也難以應(yīng)用上述的常規(guī)思路設(shè)計(jì)PCR鑒定流程。因此，以PCR為基礎(chǔ)、應(yīng)用改良的引物設(shè)計(jì)策略或新型驗(yàn)證手段的鑒定方法已逐步成為了肉類定性鑒別的新方向。其中，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性擴(kuò)增(PCRRPLF)與隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性PCR(RAPD-PCR)是兩種主要策略：前者將通用引物擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，通過(guò)物種特異性電泳圖譜進(jìn)行定性分析[15-17]，可進(jìn)行不同種的牛肉等親緣性較近的物種間的鑒別[16]；后者針對(duì)食品中基因序列未知的肉類成分，采用隨機(jī)引物得到PCR產(chǎn)物的指紋圖譜，根據(jù)指紋圖間的差別區(qū)分不同的種屬[18]。然而，PCR-RPLF的缺點(diǎn)是容易受到目標(biāo)基因序列中酶切位點(diǎn)隨機(jī)突變的影響，易產(chǎn)生檢測(cè)結(jié)果的不確定性；RAPD-PCR的重復(fù)性較差且受到食品中其他DNA成分的嚴(yán)重干擾，因此兩者均有不易標(biāo)準(zhǔn)化與廣泛應(yīng)用的劣勢(shì)。此外，PCR擴(kuò)增后的核酸序列分析也是肉制品組分鑒別的有效方法[19]，但其受制于較高的檢測(cè)成本與繁瑣的步驟等缺點(diǎn)，推廣的潛力同樣有限。值得一提的是，Bai Weibin等[20]與Ahmed等[21]分別報(bào)道了應(yīng)用通用引物多重PCR(CM-P-PCR)與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)對(duì)肉制品進(jìn)行種屬鑒別的技術(shù)，這些研究通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增方案的巧妙構(gòu)思與設(shè)計(jì)，在確保PCR鑒定高靈敏度的前提下，有效抑制非特異性擴(kuò)增，減少假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，是應(yīng)用基因擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行肉類成分定性檢測(cè)卓有成效的新思路。

近5年來(lái)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于食品中的肉類鑒別，并在提升了定性檢測(cè)準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上使得定量檢測(cè)成為可能。RTi-PCR是利用PCR反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的變化對(duì)產(chǎn)物生成進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的技術(shù)，應(yīng)用最廣泛的RTi-PCR技術(shù)包括兩類：利用雙熒光標(biāo)記探針的熒光基團(tuán)解離產(chǎn)生熒光強(qiáng)度變化的TaqMan RTi-PCR，以及利用染料分子插入雙鏈DNA產(chǎn)生熒光變化的SYBR Green RTi-PCR。在定性檢測(cè)方面，TaqMan RTi-PCR技術(shù)通過(guò)TaqMan探針與模板的結(jié)合與水解，相比于常規(guī)PCR檢測(cè)，極大改善了反應(yīng)特異性，使得同一反應(yīng)中多種肉類的同時(shí)鑒別的可靠性大大提升[22-23]；SYBR Green RTi-PCR可生成單個(gè)PCR循環(huán)的溶解曲線，可根據(jù)曲線的溶解溫度進(jìn)行種屬的定性檢測(cè)[24]?？傊?，RTi-PCR憑借其特異性好、檢測(cè)自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢(shì)，在肉制品種屬鑒別上具備良好的標(biāo)準(zhǔn)化與應(yīng)用前景。對(duì)于目前較常使用的幾種肉類成分檢測(cè)技術(shù)，其特點(diǎn)和存在問(wèn)題比較見(jiàn)表1。

表1 幾種肉類成分檢測(cè)技術(shù)的比較Table 1 Comparison of several detection technologies for meat ingredients

3 應(yīng)用RTi-PCR對(duì)食品中肉類成分的定量與溯源

在RTi-PCR反應(yīng)中，熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)Ct與模版拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，因此RTi-PCR是模版DNA定量的有效方法。應(yīng)用RTi-PCR技術(shù)對(duì)食品中肉類成分進(jìn)行定量研究也屢見(jiàn)報(bào)道[25-29]，無(wú)論使用 TaqMan RTi-PCR[22,27,29]還是SYBR Green RTi-PCR[25]，均可通過(guò)繪制Ct值與模板量的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始目標(biāo)基因進(jìn)行定量，進(jìn)而結(jié)合核酸提取效率等因素推算出樣品中特定原料肉的添加量及添加比例。應(yīng)用RTi-PCR不僅可對(duì)食品中牛肉、豬肉、羊肉、雞肉等不同種類的成分進(jìn)行定量與溯源，而且可利用TaqMan探針5＇端首個(gè)堿基差異實(shí)現(xiàn)單堿基突變或缺失的檢測(cè)，從而對(duì)混合肉類中親緣關(guān)系很近的成分如紅鹿、馬鹿、獐鹿肉進(jìn)行區(qū)別與定量[28]。

盡管近年來(lái)應(yīng)用RTi-PCR的肉類成分定量技術(shù)有了長(zhǎng)足發(fā)展，但相關(guān)方法的完善與推廣仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。首先，在目標(biāo)基因選擇方面，線粒體基因組編碼序列雖然是肉類定性鑒別的首選，但不同動(dòng)物組織中線粒體數(shù)量區(qū)別較大，在動(dòng)物組織種類未知的情況下以之作為定量檢測(cè)的目標(biāo)基因，則可能導(dǎo)致定量結(jié)果的偏差，而現(xiàn)有的部分研究卻未考慮這一因素[22]；細(xì)胞基因組中的重復(fù)序列不存在組織差異，但重復(fù)序列間的高同源性加大了特異性引物與探針設(shè)計(jì)的難度；細(xì)胞基因組中單拷貝的編碼序列在食品加工過(guò)程中降解嚴(yán)重，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度過(guò)低而不適于定量研究。因此，如何更好地選擇高保守性、多拷貝、低降解程度且組織差異小的目標(biāo)基因設(shè)計(jì)物種特異性引物和探針，將是食品中肉類成分RTi-PCR定量技術(shù)改進(jìn)面臨的首要問(wèn)題。

其次，食品加工過(guò)程導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA大量降解，使用RTi-PCR對(duì)模板DNA的定量結(jié)果必須結(jié)合DNA的降解程度才能推算出食品中原料肉的用量。經(jīng)過(guò)不同處理過(guò)程的熟制食品中DNA降解程度可相差10倍以上[27]。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，Laube等[27]在RTi-PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入myostatin基因特異性引物與探針，構(gòu)建二重的myostatin校正系統(tǒng)。由于myostatin基因在不同哺乳動(dòng)物及禽類組織中的表達(dá)水平相當(dāng)，因此將對(duì)myostatin基因的定量結(jié)果與生肉組織中的定量結(jié)果相比，即可計(jì)算出基因組DNA的降解程度，從而進(jìn)一步通過(guò)降解程度校正物種特異性擴(kuò)增的定量結(jié)果。

再者，PCR反應(yīng)易受到酶抑制劑的影響導(dǎo)致定量結(jié)果的偏差。加入已知濃度的陽(yáng)性內(nèi)參(IPC)構(gòu)建二重反應(yīng)體系是校正酶抑制劑影響的有效方法。IPC往往是人為重組的質(zhì)?；蚓€性DNA片段，體系中同時(shí)存在擴(kuò)增IPC的引物與探針，可通過(guò)對(duì)IPC擴(kuò)增Ct值的變化反映PCR反應(yīng)的抑制程度并加以校正[30]。然而時(shí)至今日，尚未見(jiàn)使用myostatin與IPC系統(tǒng)的三重?cái)U(kuò)增體系同時(shí)校正DNA降解與反應(yīng)抑制的肉類RTi-PCR定量研究報(bào)道。

此外，DNA提取效率、食品自身狀態(tài)、儲(chǔ)存時(shí)間、檢測(cè)儀器性能等因素均會(huì)對(duì)應(yīng)用RTi-PCR的肉類成分定量產(chǎn)生影響?？傊?，盡管現(xiàn)有研究已報(bào)道了諸多深加工食品、混合肉制品中肉類成分定量的成功案例，但相關(guān)方法仍處于不斷改進(jìn)、優(yōu)化與完善之中。

4 結(jié) 論

食品中肉類成分的種屬鑒定技術(shù)是打擊肉制品摻假、維護(hù)市場(chǎng)秩序的有效保障。通過(guò)檢測(cè)特征蛋白質(zhì)或其分布的肉類鑒別技術(shù)已逐步被更靈敏實(shí)用的核酸檢測(cè)所取代。如今，熒光定量PCR技術(shù)的飛速發(fā)展為肉類成分檢測(cè)開(kāi)辟了新的途徑，使得食品中肉類成分的定量分析與溯源成為可能。在定量檢測(cè)中，通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系的精巧設(shè)計(jì)而提升方法的準(zhǔn)確性與實(shí)用價(jià)值將成為相關(guān)技術(shù)的發(fā)展方向與趨勢(shì)。

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Recent Technological Advances for Identification of Meat Species in Food Products

HE Wei-ling1,2，HUANG Ming2，ZHANG Chi1,*
(1.Nanjing Institute of Supervision and Testing on Product Quality, Nanjing 210028, China；2. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095, China)

Meat adulteration is one of the worldwide challenges for food quality control. In the last decade, identification technologies for meat species in food products have been mainly focused on specific proteins or DNA sequences. The precision of analysis has been at the genus or subgenus level, and the sensitivity of detection has reached up to the nanogram grade.Recently, more attention has been paid to the quantitative analysis of meat ingredients in foods. In this paper, recent technological advances for the identification of meat species in food products are reviewed. Moreover, some current potential quantitative technologies such as real-time PCR are discussed.

meat products；adulteration；species identification；quantification

TS207.3

A

1002-6630(2012)03-0304-04

2011-03-06

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010QK178)

何瑋玲(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿忸愘|(zhì)量與安全控制。E-mail：2010108020@njau.edu.cn

*通信作者：張馳(1978—)，男，工程師，博士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：cavy78@gmail.com