陳 江 楊柳明 趙延龍 崔 彬 王麗紅

廣東省廉江市人民醫(yī)院肝病中心，廣東廉江 524400

乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白（HBx）是一個(gè)多功能調(diào)節(jié)蛋白，對(duì)于啟動(dòng)和維持HBV的復(fù)制是必須的，是HBV自然感染過(guò)程中的關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子；是HBV感染誘發(fā)肝細(xì)胞癌變的主要蛋白，故亦稱癌蛋白。HBV相關(guān)肝癌多發(fā)生于男性的原因是和雄激素及雄激素受體（androgen receptor，AR）有關(guān)[1]。肝癌的發(fā)生常伴抑癌基因p53的改變[2]。本研究采用SP免疫組化方法檢測(cè)三者在HBV相關(guān)肝癌中的表達(dá)及關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2000年2月～2010年5月廉江人民醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為HCC且有完整隨訪資料的標(biāo)本58例，患者均未經(jīng)過(guò)任何抗腫瘤治療，HbsAg均為陽(yáng)性。男46例，女12例；年齡23～86歲，中位年齡60歲；47例AFP≥400μg/L，11例 AFP＜400μg/L，39例腫瘤直徑≥5cm，19例＜5 cm，TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期46例。Edmondson-Steiner分級(jí)：Ⅰ～Ⅱ級(jí)6例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)52例。伴有門(mén)靜脈癌栓18例，腹腔淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移9例。

1.2 試劑

HBx蛋白抗體及鼠抗人p53單克隆抗體及S-P試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。兔抗人雄激素受體抗血清購(gòu)自Sigma公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

采用SP免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HBx、AR及P53蛋白的表達(dá)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟嚴(yán)格進(jìn)行操作。用已知陽(yáng)性組織切片做陽(yáng)性對(duì)照，以PBS液做陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷

參照蔣成英等[3]的判斷標(biāo)準(zhǔn)。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，染色細(xì)胞＜5%計(jì)0分，5%～24%計(jì)1分，25%～49%計(jì)2分，50%～74%計(jì)3分，≥75%計(jì)4分。染色強(qiáng)度：細(xì)胞不著色計(jì)0分；淺黃色計(jì)1分；棕黃色計(jì)2分；棕褐色計(jì)3分。染色強(qiáng)度得分與陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)得分相乘，0分為陰性，1～4分為弱陽(yáng)性（+），5～8 分為中度陽(yáng)性（++），9～12 分為強(qiáng) 陽(yáng)性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

根據(jù)實(shí)驗(yàn)資料的性質(zhì)，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)所得資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC中HBx、AR及P53的表達(dá)

少數(shù)定位于細(xì)胞核（圖1），AR陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核（圖2），P53陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核及核膜上（圖3）。HCC和癌旁組織中 HBx及 AR的表達(dá)率為 63.8%（37/58）、58.6%（34/58） 及 62.0%（36/58） 和 20.9%（12/58）、27.6%（16/58）及8.6%（5/58），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

圖1 HBx陽(yáng)性表達(dá)（SP×200）

圖2 AR陽(yáng)性表達(dá)（SP×200）

圖3 P53陽(yáng)性表達(dá)（SP×200）

2.2 HCC中HBx、AR及P53表達(dá)的相關(guān)性

HBx陽(yáng)性和HBx陰性的HCC組織中AR的表達(dá)率分別為 72.3%（27/37）、83.8（31/37）和 33.3%（7/21）、23.8（5/21），在HCC組織中HBx表達(dá)與AR表達(dá)正相關(guān)（r=0.453 2及r=0.475 4，P ＜ 0.05）。

2.3 HBx、AR表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

HBx染色的陽(yáng)性率與AFP水平和分化程度相關(guān)；AR染色的陽(yáng)性率與性別及腫瘤直徑相關(guān)，p53染色的陽(yáng)性率與TNM分期相關(guān)。見(jiàn)表1。

3 討論

流行病學(xué)研究顯示全世界80%以上的HCC與慢性乙型肝炎或丙性肝炎有關(guān)，由于病毒流行的地域不同，中國(guó)的HCC大部分是HBV相關(guān)性的，HBV相關(guān)HCC的顯著特點(diǎn)是男性多發(fā)，與HCV感染者相比HBV感染者更容易發(fā)生HCC，研究者發(fā)現(xiàn)HBV的X蛋白與宿主肝細(xì)胞AR信號(hào)通路系統(tǒng)的相互作用是HBV相關(guān)HCC高發(fā)于男性的主要原因[4]。

HBx蛋白是多功能病毒調(diào)節(jié)因子，調(diào)控轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞對(duì)基因毒性壓力的應(yīng)激反應(yīng)、蛋白降解及信號(hào)通路，是肝癌發(fā)生過(guò)程中最重要的病毒因子[5]。在肝癌細(xì)胞株及HBx轉(zhuǎn)基因小鼠的研究已經(jīng)證明HBx可以增加AR的轉(zhuǎn)錄活性，離體研究表明HBx可以增加AR蛋白質(zhì)的水平并且通過(guò)其蛋白體酶活性增加AR的穩(wěn)定性。AR信號(hào)系統(tǒng)會(huì)增加肝細(xì)胞癌變的危險(xiǎn)，AR可以被認(rèn)為是一種癌基因，宿主細(xì)胞在癌變過(guò)程中AR轉(zhuǎn)錄活性的增加是主要原因，Zhu等[4]采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、蛋白印記及免疫組織化學(xué)染色等方法檢測(cè)HBV相關(guān)HCC及HBV陰性HCC中的AR表達(dá)發(fā)現(xiàn)，HBV相關(guān)HCC組織中AR的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯高于HBV陰性的HCC組織中的表達(dá)，轉(zhuǎn)染HBx的L02及BEL-74004肝癌細(xì)胞株AR的表達(dá)明顯升高，提示HBx通過(guò)刺激轉(zhuǎn)錄增加AR的表達(dá)。與本試驗(yàn)的結(jié)果相仿，表明AR在HBV相關(guān)HCC的發(fā)生中起作用。

近幾年致癌作用中的表觀遺傳學(xué)改變備受關(guān)注，甲基化是表觀遺傳學(xué)改變的一種重要基因修飾方式，HBx蛋白是人肝細(xì)胞內(nèi)主要的甲基化改變調(diào)節(jié)因子，在HBV誘發(fā)的肝癌發(fā)生早期HBx通過(guò)激活DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因使抑癌基因啟動(dòng)子甲基化抑癌基因低表達(dá)。AR啟動(dòng)子CpG島DNA的甲基化使AR在前列腺癌細(xì)胞及組織內(nèi)的表達(dá)下降，而在HBV相關(guān)HCC組織中AR表達(dá)不伴其啟動(dòng)子甲基化，AR的甲基化狀態(tài)與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）水平無(wú)關(guān)，HBV相關(guān)HCC組織中AR的表達(dá)及甲基化與前列腺癌不同，是組織特異性的[4]。

P53是最強(qiáng)的腫瘤抑制因子，在細(xì)胞應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，P53相應(yīng)的會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯或發(fā)生凋亡。在非應(yīng)激狀態(tài)下，P53受其負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子MDM2（murine double mimute 2）蛋白的嚴(yán)密調(diào)控，P53激活MDM2基因的轉(zhuǎn)錄反過(guò)來(lái)MDM2蛋白又抑制P53的轉(zhuǎn)錄活性。在這種反射弧的調(diào)節(jié)下，P53及MDM2平時(shí)都維持較低水平，在應(yīng)對(duì)應(yīng)激時(shí)細(xì)胞內(nèi)的P53水平增加導(dǎo)致下游靶基因的激活及P53通路系統(tǒng)的功能激活，發(fā)生細(xì)胞周期阻滯及凋亡[6]。P53對(duì)AR也具有調(diào)節(jié)作用，盡管P53控制AR的精確機(jī)制尚不明確，但P53基因的過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制AR依賴基因的表達(dá)可以明顯降低AR的功能[7]。生理水平的P53對(duì)雄激素信號(hào)系統(tǒng)有保護(hù)作用，當(dāng)P53與AR基因的啟動(dòng)子穩(wěn)定結(jié)合后雄激素信號(hào)系統(tǒng)的功能明顯減弱，P53的負(fù)性調(diào)節(jié)因子MDM2也可以通過(guò)泛素依賴的蛋白降解作用調(diào)節(jié)AR蛋白水平[6]。

表1 臨床病理特征與肝癌組織中HBx、AR及p53陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系[n（%）]

HBV感染及男性是HCC發(fā)生的兩個(gè)高危因子，HBV的HBx蛋白是肝癌發(fā)生過(guò)程中的始動(dòng)因子，參與肝癌發(fā)生的一系列改變，包括AR系統(tǒng)的活化。雄激素及AR信號(hào)系統(tǒng)是宿主應(yīng)答HBx作用的信號(hào)系統(tǒng)之一，另外，HBx可以導(dǎo)致P53通路介導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及凋亡抑制。本試驗(yàn)研究顯示HBx表達(dá)與AR及P53顯著中相關(guān)，該結(jié)果印證了三者的關(guān)系。三種蛋白在不同臨床病理特征的HCC中的不同表達(dá)，提示三者在HCC發(fā)生發(fā)展的不同階段起不同作用。國(guó)際多中心隨機(jī)臨床試驗(yàn)表明抗雄激素治療對(duì)HCC療效不明顯，臺(tái)灣學(xué)者M(jìn)ing等[8]動(dòng)物試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)二甲氧基姜黃素（ASC-J9）可拮抗和降解雄激素受體，以抑制雄激素受體（AR）的表達(dá)，使AR的量減少，從而抑制HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌細(xì)胞的增殖。MDM2拮抗劑Nutlin-3α是一種小分子化合物通過(guò)干擾P53-MDM2反射弧激活p53通路使野生型p53表達(dá)升高癌細(xì)胞凋亡，是一種增加野生型p53活性的抗治療藥物[6]，本試驗(yàn)肝癌組織中p53的陽(yáng)性率為62.0%（突變型），p53突變與肝癌發(fā)生顯著相關(guān)。肝癌是一種治療手段有限的腫瘤，本試驗(yàn)研究表明HBx、AR及p53在肝癌發(fā)生發(fā)展中作用重要，針對(duì)這三個(gè)“靶點(diǎn)”綜合治療方案，如抗病毒（降低HBx水平）治療加拮抗和降解雄激素受體治療（ASC-J9）加MDM2拮抗劑可能成為HCC治療的一種新思路。

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