申 彥 李建文 張雁鋼

1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030001；2.山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院山西大醫(yī)院泌尿外科，山西太原 030001

膀胱腫瘤是泌尿系腫瘤中最常見的腫瘤，多數(shù)為移行上皮細(xì)胞癌，國外膀胱腫瘤的發(fā)病率在男性泌尿生殖器腫瘤中僅次于前列腺癌，居第2位，在國內(nèi)則占首位。隨著對生存素（Survivin）基因的研究深入，發(fā)現(xiàn)Survivin基因作為一種凋亡抑制基因在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用，且與腫瘤的分級、分期密切相關(guān)。本研究應(yīng)用中藥瑞香狼毒水提取物作用于人膀胱癌T24細(xì)胞，探討瑞香狼毒對膀胱癌T24細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以期為臨床開辟新治療途徑提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 來源 人膀胱癌T24細(xì)胞株由山西醫(yī)科大學(xué)寄生蟲實驗中心提供。瑞香狼毒購自山西省醫(yī)藥公司，山西醫(yī)科大學(xué)藥物學(xué)院進(jìn)行藥物提取。

1.1.2 主要試劑 RPMI-1640為賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司產(chǎn)品；胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)；二甲基亞砜（DMSO）為天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心產(chǎn)品；絲裂霉素為日本協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社富士工廠產(chǎn)品；兔抗人Survivin單克隆抗體（工作液）為中杉金橋公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要設(shè)備 超凈工作臺，相差倒置顯微鏡，二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，水浴箱，水平離心機(jī)，全自動ELX800酶聯(lián)免疫分析儀，流式細(xì)胞儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將膀胱癌T24細(xì)胞復(fù)蘇后接種至培養(yǎng)瓶，加含有10%胎牛血清和雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基5 mL瓶蓋微松，放置37℃，5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每2～3天更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長至貼滿培養(yǎng)瓶壁時，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 MTT法檢測膀胱癌T24細(xì)胞抑制率 將細(xì)胞消化、計數(shù)，將其接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔5×104個細(xì)胞，容積100 μL，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h細(xì)胞貼壁后，于96孔板中依次加入不同濃度的瑞香狼毒水提取物（0.04、0.2、1、5 g/mL）每一濃度設(shè)6個復(fù)孔，同時設(shè)一個空白組（僅加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基）和對照組（未加藥物的100 μL細(xì)胞懸液）。繼續(xù)培養(yǎng) 12、24、48、72 h 后， 每孔加入 MTT 試劑 20 μL，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加二甲基亞砜100 μL置搖床上混勻，10 min后用酶標(biāo)儀在490 nm發(fā)射波長下讀OD數(shù)值，計算細(xì)胞抑制率。抑制率的計算：抑制率=（1-OD處理組/OD對照組）×100%。

1.2.3 細(xì)胞凋亡率的檢測 將對數(shù)生長期的膀胱癌T24細(xì)胞消化、計數(shù)，種植于6孔板內(nèi)，每孔1×106個細(xì)胞，容積3 mL。待12 h細(xì)胞附壁后加入不同濃度藥物。實驗分為對照組（未加藥物的 100 μL 細(xì)胞懸液），藥物組（0.04、0.2、1、5 g/mL）每組設(shè)5個復(fù)孔，作用48 h后收集細(xì)胞，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué) 取對數(shù)生長期膀胱癌T24細(xì)胞，消化、計數(shù)，種植于6孔板內(nèi)，每孔1×105個細(xì)胞，容積3 mL。12 h細(xì)胞附壁后加藥干預(yù)，實驗分為對照組（未加藥物的100 μL細(xì)胞懸液），藥物組（0.04、0.2、1、5 g/mL）每組設(shè) 5 個復(fù)孔，作用48 h后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，加入兔抗人Survivin單克隆抗體工作液，4℃溫箱孵育過夜，次日滴加二抗（羊抗兔）、顯色劑，封片后觀察細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)。實驗以細(xì)胞胞漿或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果，在顯微鏡下拍照并行灰度值測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，多個樣本均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni法檢驗，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測結(jié)果

瑞香狼毒水提取物對膀胱癌T24細(xì)胞的生長抑制作用通過MTT法檢測不同濃度藥物分別處理12、24、48、72 h后，測各組細(xì)胞吸光度（表1）及抑制率（表2），結(jié)果顯示瑞香狼毒水提取物對該細(xì)胞株有明顯的生長抑制作用，濃度越高作用，時間越長，抑制作用越明顯。

表1 不同濃度瑞香狼毒水提取物對膀胱癌T24細(xì)胞作用的OD值（±s）

表1 不同濃度瑞香狼毒水提取物對膀胱癌T24細(xì)胞作用的OD值（±s）

注：與對照組比較，★P＜0.05；每個藥物濃度組與前一藥物濃度組比較，△P＜0.05；每個時間段與前一時間段比較，○P＜0.05

藥物濃度（g/mL）OD值12 h 24 h 48 h 72 h對照組0.04 0.2 15 0.69±0.03 0.61±0.03★0.56±0.07★0.40±0.02★△0.32±0.05★△0.73±0.04 0.57±0.03★0.43±0.02★△○0.37±0.06★0.28±0.03★△0.76±0.04 0.53±0.05★0.38±0.03★△○0.30±0.05★△○0.22±0.05★△○0.82±0.04 0.46±0.05★○0.28±0.05★△○0.23±0.05★○0.15±0.02★△○

2.2 凋亡率檢測結(jié)果

藥物組（0.04、0.2、1、5 g/mL）分別作用于膀胱癌 T24 細(xì)胞 48 h 后，細(xì)胞凋亡率分別為（11.67±2.61）%、（22.40±3.18）%、（38.29±2.30）%、（57.57±3.77）%，各組與對照組凋亡率[（1.05±0.34）%]比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），高濃度組與低濃度組比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增高，膀胱癌T24細(xì)胞的凋亡率增加。

表2 不同濃度瑞香狼毒水提取物對膀胱癌T24細(xì)胞增殖抑制率（±s，%）

表2 不同濃度瑞香狼毒水提取物對膀胱癌T24細(xì)胞增殖抑制率（±s，%）

注：每個濃度組與前一濃度組比較，▲P＜0.05；每個時間段與前一時間段比較，◇P＜0.05

藥物濃度（g/mL）抑制率12 h 24 h 48 h 72 h 0.04 0.2 15 12.49±4.09 19.10±9.68 42.33±3.52▲54.55±6.77▲21.99±4.48◇41.40±3.22▲◇48.86±7.65 61.16±4.48▲30.00±6.44 50.01±3.31▲60.74±6.64▲◇71.58±6.03▲◇44.72±5.67◇65.70±6.23▲◇71.58±5.84◇81.59±2.26▲◇

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果

藥物組（0.04、0.2、1、5 g/mL）分別作用于膀胱癌 T24 細(xì)胞48 h后，經(jīng)過免疫細(xì)胞化學(xué)染色、封片、顯微鏡下拍照后，測各組灰度值分別為（142.49±1.67）、（152.14±2.66）、（161.63±4.44）、（171.72±1.17），各組與對照組灰度值（130.84±4.99）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），高濃度組與低濃度組比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果顯示，瑞香狼毒水提取物作用于膀胱癌T24細(xì)胞后，下調(diào)細(xì)胞中Survivn蛋白表達(dá)，濃度越高，下調(diào)作用愈明顯。

3 討論

瑞香狼毒為瑞香科狼毒屬植物，又名紅狼毒、棉大戟、斷腸草等，為中藥狼毒之正品，有毒，用藥部位為根，性味苦平，有逐水祛痰、破積殺蟲之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等活性[1]。國外膀胱癌的發(fā)病率在男性泌尿生殖腫瘤中僅次于前列腺癌，在我國則占首位。目前，國內(nèi)外采用綜合治療措施，藥物治療在其中發(fā)揮重要作用。國內(nèi)外學(xué)者在瑞香狼毒對肺癌、肝癌、宮頸癌等惡性腫瘤的研究中取得一定成果[2-4]，但對泌尿系統(tǒng)如膀胱癌細(xì)胞的抗腫瘤研究少有報道。Survivin是近年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制因子，具有高度保守性和明顯抵抗細(xì)胞凋亡的作用，參與調(diào)控細(xì)胞分裂、增殖等過程[5]。Survivin在除胸腺外正常組織中不表達(dá)，而在大部分腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[6]。Survivin基因作為一種凋亡抑制基因在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用[7-8]，其表達(dá)情況與腫瘤的分級、分期密切相關(guān)[9-10]，可以作為膀胱癌早期診斷及判斷預(yù)后的檢查指標(biāo)[11]。本實驗研究選擇人膀胱癌T24細(xì)胞株，給予膀胱癌T24細(xì)胞不同濃度瑞香狼毒處理后，觀察細(xì)胞的抑制率、凋亡率以及Survivin蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果顯示：瑞香狼毒水提取物對膀胱癌T24細(xì)胞具有明顯的抑制作用，具有濃度和時間依賴性。研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒水提取物促進(jìn)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡并下調(diào)Survivin蛋白的表達(dá)。

綜上所述，瑞香狼毒水提取物可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與Survivin蛋白表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。由于藥物促使腫瘤細(xì)胞凋亡是通過多條途徑共同作用的結(jié)果，因此需要進(jìn)一步深入研究，為開辟膀胱癌臨床治療新途徑提供理論依據(jù)。

[1]羅慧英，王愛勤.不同極性溶媒瑞香狼毒提取物的抗腫瘤活性比較[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005，10（10）：1140-1141.

[2]Yoshida M，Yokokura H，Hidaka H，et al.Mechanism of antitum or action of PKC activator，gnidimacrin[J].Int J Cancer，1998，77（2）：243-252.

[3]馮威健，池川哲郎，吉田光二.瑞香狼毒提取物尼地嗎啉的抗癌活性[J].中華腫瘤雜志，1995，17（1）：24-29.

[4]Yoshida M，F(xiàn)eng WJ，Saijo N，et al.Antitum or activity of daphnanetype diterpene gnidimacrin isolated from Stellera chamaejasme L [J].Int J Cancer，1996，66（2）：268-278.

[5]Ambrosini G，Adida C，Altieri DC.Anovel antiapoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma[J].Nat Med，1997，3（8）：917-921.

[6]Hoffman WH，Biade S，Zilfou JT，et al.Transcriptional repression of the anti-apoptotic survivin gene by wild type p53 [J].J Biol Chem，2002，277（5）：3247-3257.

[7]Kitsukawa S，Aoyagi T，Noda K，et al.Quantitative analysis of survivin mRNA expression in bladder transitional cell carcinomas[J].Hinyokika Kiyo，2008，54（2）：101-106.

[8]Kitamura H，Torigoe T，Honma I，et al.Expression and antigenicity of survivin，an inhibitor of apoptosis family member，in bladder cancer：implications for specific immunotherapy[J].Urology，2006，67（5）：955-959.

[9]Karam JA，Lotan Y，Ashfaq R,et al.Survivin expression in patients with non-muscle invasive urothelial cell carcinoma of the bladder[J].Urology，2007，70（3）：482-486.

[10]Swana HS，Grossman D，Anthony JN，et al.Tumor content of the anti apoptosis molecule survivin and recurrence of bladder cancer [J].N Engl J Med，1999，341（6）：452-453.

[11]Schultz IJ，Kiemeney LA，Karthaus HF，et al.Survivin mRNA copy number in bladder washings predicts tumor recurrence in patients with superficial urothelial cell carcinomas [J].Clin Chem，2004，50（8）：1425-1428.