申 彥 李建文 張雁鋼

1.山西醫(yī)科大學，山西太原 030001；2.山西醫(yī)學科學院山西大醫(yī)院泌尿外科，山西太原 030001

膀胱腫瘤是泌尿系腫瘤中最常見的腫瘤，多數(shù)為移行上皮細胞癌，國外膀胱腫瘤的發(fā)病率在男性泌尿生殖器腫瘤中僅次于前列腺癌，居第2位，在國內則占首位。隨著對生存素（Survivin）基因的研究深入，發(fā)現(xiàn)Survivin基因作為一種凋亡抑制基因在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用，且與腫瘤的分級、分期密切相關。本研究應用中藥瑞香狼毒水提取物作用于人膀胱癌T24細胞，探討瑞香狼毒對膀胱癌T24細胞生物學行為的影響，以期為臨床開辟新治療途徑提供理論依據。現(xiàn)將結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 來源 人膀胱癌T24細胞株由山西醫(yī)科大學寄生蟲實驗中心提供。瑞香狼毒購自山西省醫(yī)藥公司，山西醫(yī)科大學藥物學院進行藥物提取。

1.1.2 主要試劑 RPMI-1640為賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司產品；胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產；二甲基亞砜（DMSO）為天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心產品；絲裂霉素為日本協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社富士工廠產品；兔抗人Survivin單克隆抗體（工作液）為中杉金橋公司產品。

1.1.3 主要設備 超凈工作臺，相差倒置顯微鏡，二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，水浴箱，水平離心機，全自動ELX800酶聯(lián)免疫分析儀，流式細胞儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將膀胱癌T24細胞復蘇后接種至培養(yǎng)瓶，加含有10%胎牛血清和雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基5 mL瓶蓋微松，放置37℃，5%CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中，每2～3天更換培養(yǎng)液，待細胞生長至貼滿培養(yǎng)瓶壁時，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 MTT法檢測膀胱癌T24細胞抑制率 將細胞消化、計數(shù)，將其接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔5×104個細胞，容積100 μL，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h細胞貼壁后，于96孔板中依次加入不同濃度的瑞香狼毒水提取物（0.04、0.2、1、5 g/mL）每一濃度設6個復孔，同時設一個空白組（僅加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基）和對照組（未加藥物的100 μL細胞懸液）。繼續(xù)培養(yǎng) 12、24、48、72 h 后， 每孔加入 MTT 試劑 20 μL，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加二甲基亞砜100 μL置搖床上混勻，10 min后用酶標儀在490 nm發(fā)射波長下讀OD數(shù)值，計算細胞抑制率。抑制率的計算：抑制率=（1-OD處理組/OD對照組）×100%。

1.2.3 細胞凋亡率的檢測 將對數(shù)生長期的膀胱癌T24細胞消化、計數(shù)，種植于6孔板內，每孔1×106個細胞，容積3 mL。待12 h細胞附壁后加入不同濃度藥物。實驗分為對照組（未加藥物的 100 μL 細胞懸液），藥物組（0.04、0.2、1、5 g/mL）每組設5個復孔，作用48 h后收集細胞，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑進行染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 免疫細胞化學 取對數(shù)生長期膀胱癌T24細胞，消化、計數(shù)，種植于6孔板內，每孔1×105個細胞，容積3 mL。12 h細胞附壁后加藥干預，實驗分為對照組（未加藥物的100 μL細胞懸液），藥物組（0.04、0.2、1、5 g/mL）每組設 5 個復孔，作用48 h后進行免疫細胞化學染色，加入兔抗人Survivin單克隆抗體工作液，4℃溫箱孵育過夜，次日滴加二抗（羊抗兔）、顯色劑，封片后觀察細胞Survivin蛋白的表達。實驗以細胞胞漿或細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結果，在顯微鏡下拍照并行灰度值測定。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0軟件對數(shù)據進行單因素方差分析，多個樣本均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni法檢驗，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT法檢測結果

瑞香狼毒水提取物對膀胱癌T24細胞的生長抑制作用通過MTT法檢測不同濃度藥物分別處理12、24、48、72 h后，測各組細胞吸光度（表1）及抑制率（表2），結果顯示瑞香狼毒水提取物對該細胞株有明顯的生長抑制作用，濃度越高作用，時間越長，抑制作用越明顯。

表1 不同濃度瑞香狼毒水提取物對膀胱癌T24細胞作用的OD值（±s）

表1 不同濃度瑞香狼毒水提取物對膀胱癌T24細胞作用的OD值（±s）

注：與對照組比較，★P＜0.05；每個藥物濃度組與前一藥物濃度組比較，△P＜0.05；每個時間段與前一時間段比較，○P＜0.05

藥物濃度（g/mL）OD值12 h 24 h 48 h 72 h對照組0.04 0.2 15 0.69±0.03 0.61±0.03★0.56±0.07★0.40±0.02★△0.32±0.05★△0.73±0.04 0.57±0.03★0.43±0.02★△○0.37±0.06★0.28±0.03★△0.76±0.04 0.53±0.05★0.38±0.03★△○0.30±0.05★△○0.22±0.05★△○0.82±0.04 0.46±0.05★○0.28±0.05★△○0.23±0.05★○0.15±0.02★△○

2.2 凋亡率檢測結果

藥物組（0.04、0.2、1、5 g/mL）分別作用于膀胱癌 T24 細胞 48 h 后，細胞凋亡率分別為（11.67±2.61）%、（22.40±3.18）%、（38.29±2.30）%、（57.57±3.77）%，各組與對照組凋亡率[（1.05±0.34）%]比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），高濃度組與低濃度組比較差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果顯示，隨著藥物濃度的增高，膀胱癌T24細胞的凋亡率增加。

表2 不同濃度瑞香狼毒水提取物對膀胱癌T24細胞增殖抑制率（±s，%）

表2 不同濃度瑞香狼毒水提取物對膀胱癌T24細胞增殖抑制率（±s，%）

注：每個濃度組與前一濃度組比較，▲P＜0.05；每個時間段與前一時間段比較，◇P＜0.05

藥物濃度（g/mL）抑制率12 h 24 h 48 h 72 h 0.04 0.2 15 12.49±4.09 19.10±9.68 42.33±3.52▲54.55±6.77▲21.99±4.48◇41.40±3.22▲◇48.86±7.65 61.16±4.48▲30.00±6.44 50.01±3.31▲60.74±6.64▲◇71.58±6.03▲◇44.72±5.67◇65.70±6.23▲◇71.58±5.84◇81.59±2.26▲◇

2.3 免疫細胞化學結果

藥物組（0.04、0.2、1、5 g/mL）分別作用于膀胱癌 T24 細胞48 h后，經過免疫細胞化學染色、封片、顯微鏡下拍照后，測各組灰度值分別為（142.49±1.67）、（152.14±2.66）、（161.63±4.44）、（171.72±1.17），各組與對照組灰度值（130.84±4.99）比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），高濃度組與低濃度組比較差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果顯示，瑞香狼毒水提取物作用于膀胱癌T24細胞后，下調細胞中Survivn蛋白表達，濃度越高，下調作用愈明顯。

3 討論

瑞香狼毒為瑞香科狼毒屬植物，又名紅狼毒、棉大戟、斷腸草等，為中藥狼毒之正品，有毒，用藥部位為根，性味苦平，有逐水祛痰、破積殺蟲之功效?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤、抗病毒、調節(jié)免疫等活性[1]。國外膀胱癌的發(fā)病率在男性泌尿生殖腫瘤中僅次于前列腺癌，在我國則占首位。目前，國內外采用綜合治療措施，藥物治療在其中發(fā)揮重要作用。國內外學者在瑞香狼毒對肺癌、肝癌、宮頸癌等惡性腫瘤的研究中取得一定成果[2-4]，但對泌尿系統(tǒng)如膀胱癌細胞的抗腫瘤研究少有報道。Survivin是近年發(fā)現(xiàn)的細胞凋亡抑制因子，具有高度保守性和明顯抵抗細胞凋亡的作用，參與調控細胞分裂、增殖等過程[5]。Survivin在除胸腺外正常組織中不表達，而在大部分腫瘤細胞中高表達[6]。Survivin基因作為一種凋亡抑制基因在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用[7-8]，其表達情況與腫瘤的分級、分期密切相關[9-10]，可以作為膀胱癌早期診斷及判斷預后的檢查指標[11]。本實驗研究選擇人膀胱癌T24細胞株，給予膀胱癌T24細胞不同濃度瑞香狼毒處理后，觀察細胞的抑制率、凋亡率以及Survivin蛋白表達的情況。結果顯示：瑞香狼毒水提取物對膀胱癌T24細胞具有明顯的抑制作用，具有濃度和時間依賴性。研究結果還發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒水提取物促進膀胱癌T24細胞凋亡并下調Survivin蛋白的表達。

綜上所述，瑞香狼毒水提取物可誘導膀胱癌細胞發(fā)生凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，其作用機制可能與Survivin蛋白表達的下調有關。由于藥物促使腫瘤細胞凋亡是通過多條途徑共同作用的結果，因此需要進一步深入研究，為開辟膀胱癌臨床治療新途徑提供理論依據。

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