申 彥 李建文 張雁鋼
1.山西醫(yī)科大學(xué),山西太原 030001;2.山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院山西大醫(yī)院泌尿外科,山西太原 030001
膀胱腫瘤是泌尿系腫瘤中最常見的腫瘤,多數(shù)為移行上皮細(xì)胞癌,國外膀胱腫瘤的發(fā)病率在男性泌尿生殖器腫瘤中僅次于前列腺癌,居第2位,在國內(nèi)則占首位。隨著對生存素(Survivin)基因的研究深入,發(fā)現(xiàn)Survivin基因作為一種凋亡抑制基因在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用,且與腫瘤的分級、分期密切相關(guān)。本研究應(yīng)用中藥瑞香狼毒水提取物作用于人膀胱癌T24細(xì)胞,探討瑞香狼毒對膀胱癌T24細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,以期為臨床開辟新治療途徑提供理論依據(jù)?,F(xiàn)將結(jié)果報道如下:
1.1.1 來源 人膀胱癌T24細(xì)胞株由山西醫(yī)科大學(xué)寄生蟲實驗中心提供。瑞香狼毒購自山西省醫(yī)藥公司,山西醫(yī)科大學(xué)藥物學(xué)院進(jìn)行藥物提取。
1.1.2 主要試劑 RPMI-1640為賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn);二甲基亞砜(DMSO)為天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心產(chǎn)品;絲裂霉素為日本協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社富士工廠產(chǎn)品;兔抗人Survivin單克隆抗體(工作液)為中杉金橋公司產(chǎn)品。
1.1.3 主要設(shè)備 超凈工作臺,相差倒置顯微鏡,二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱,水浴箱,水平離心機(jī),全自動ELX800酶聯(lián)免疫分析儀,流式細(xì)胞儀。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將膀胱癌T24細(xì)胞復(fù)蘇后接種至培養(yǎng)瓶,加含有10%胎牛血清和雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基5 mL瓶蓋微松,放置37℃,5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,每2~3天更換培養(yǎng)液,待細(xì)胞生長至貼滿培養(yǎng)瓶壁時,用0.25%胰酶消化傳代。
1.2.2 MTT法檢測膀胱癌T24細(xì)胞抑制率 將細(xì)胞消化、計數(shù),將其接種至96孔培養(yǎng)板中,每孔5×104個細(xì)胞,容積100 μL,置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h細(xì)胞貼壁后,于96孔板中依次加入不同濃度的瑞香狼毒水提取物(0.04、0.2、1、5 g/mL)每一濃度設(shè)6個復(fù)孔,同時設(shè)一個空白組(僅加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基)和對照組(未加藥物的100 μL細(xì)胞懸液)。繼續(xù)培養(yǎng) 12、24、48、72 h 后, 每孔加入 MTT 試劑 20 μL,置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清,每孔加二甲基亞砜100 μL置搖床上混勻,10 min后用酶標(biāo)儀在490 nm發(fā)射波長下讀OD數(shù)值,計算細(xì)胞抑制率。抑制率的計算:抑制率=(1-OD處理組/OD對照組)×100%。
1.2.3 細(xì)胞凋亡率的檢測 將對數(shù)生長期的膀胱癌T24細(xì)胞消化、計數(shù),種植于6孔板內(nèi),每孔1×106個細(xì)胞,容積3 mL。待12 h細(xì)胞附壁后加入不同濃度藥物。實驗分為對照組(未加藥物的 100 μL 細(xì)胞懸液),藥物組(0.04、0.2、1、5 g/mL)每組設(shè)5個復(fù)孔,作用48 h后收集細(xì)胞,Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑進(jìn)行染色,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。
1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué) 取對數(shù)生長期膀胱癌T24細(xì)胞,消化、計數(shù),種植于6孔板內(nèi),每孔1×105個細(xì)胞,容積3 mL。12 h細(xì)胞附壁后加藥干預(yù),實驗分為對照組(未加藥物的100 μL細(xì)胞懸液),藥物組(0.04、0.2、1、5 g/mL)每組設(shè) 5 個復(fù)孔,作用48 h后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,加入兔抗人Survivin單克隆抗體工作液,4℃溫箱孵育過夜,次日滴加二抗(羊抗兔)、顯色劑,封片后觀察細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)。實驗以細(xì)胞胞漿或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果,在顯微鏡下拍照并行灰度值測定。
應(yīng)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,多個樣本均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni法檢驗,計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
瑞香狼毒水提取物對膀胱癌T24細(xì)胞的生長抑制作用通過MTT法檢測不同濃度藥物分別處理12、24、48、72 h后,測各組細(xì)胞吸光度(表1)及抑制率(表2),結(jié)果顯示瑞香狼毒水提取物對該細(xì)胞株有明顯的生長抑制作用,濃度越高作用,時間越長,抑制作用越明顯。
表1 不同濃度瑞香狼毒水提取物對膀胱癌T24細(xì)胞作用的OD值(±s)
表1 不同濃度瑞香狼毒水提取物對膀胱癌T24細(xì)胞作用的OD值(±s)
注:與對照組比較,★P<0.05;每個藥物濃度組與前一藥物濃度組比較,△P<0.05;每個時間段與前一時間段比較,○P<0.05
藥物濃度(g/mL)OD值12 h 24 h 48 h 72 h對照組0.04 0.2 15 0.69±0.03 0.61±0.03★0.56±0.07★0.40±0.02★△0.32±0.05★△0.73±0.04 0.57±0.03★0.43±0.02★△○0.37±0.06★0.28±0.03★△0.76±0.04 0.53±0.05★0.38±0.03★△○0.30±0.05★△○0.22±0.05★△○0.82±0.04 0.46±0.05★○0.28±0.05★△○0.23±0.05★○0.15±0.02★△○
藥物組(0.04、0.2、1、5 g/mL)分別作用于膀胱癌 T24 細(xì)胞 48 h 后,細(xì)胞凋亡率分別為(11.67±2.61)%、(22.40±3.18)%、(38.29±2.30)%、(57.57±3.77)%,各組與對照組凋亡率[(1.05±0.34)%]比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),高濃度組與低濃度組比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果顯示,隨著藥物濃度的增高,膀胱癌T24細(xì)胞的凋亡率增加。
表2 不同濃度瑞香狼毒水提取物對膀胱癌T24細(xì)胞增殖抑制率(±s,%)
表2 不同濃度瑞香狼毒水提取物對膀胱癌T24細(xì)胞增殖抑制率(±s,%)
注:每個濃度組與前一濃度組比較,▲P<0.05;每個時間段與前一時間段比較,◇P<0.05
藥物濃度(g/mL)抑制率12 h 24 h 48 h 72 h 0.04 0.2 15 12.49±4.09 19.10±9.68 42.33±3.52▲54.55±6.77▲21.99±4.48◇41.40±3.22▲◇48.86±7.65 61.16±4.48▲30.00±6.44 50.01±3.31▲60.74±6.64▲◇71.58±6.03▲◇44.72±5.67◇65.70±6.23▲◇71.58±5.84◇81.59±2.26▲◇
藥物組(0.04、0.2、1、5 g/mL)分別作用于膀胱癌 T24 細(xì)胞48 h后,經(jīng)過免疫細(xì)胞化學(xué)染色、封片、顯微鏡下拍照后,測各組灰度值分別為(142.49±1.67)、(152.14±2.66)、(161.63±4.44)、(171.72±1.17),各組與對照組灰度值(130.84±4.99)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),高濃度組與低濃度組比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果顯示,瑞香狼毒水提取物作用于膀胱癌T24細(xì)胞后,下調(diào)細(xì)胞中Survivn蛋白表達(dá),濃度越高,下調(diào)作用愈明顯。
瑞香狼毒為瑞香科狼毒屬植物,又名紅狼毒、棉大戟、斷腸草等,為中藥狼毒之正品,有毒,用藥部位為根,性味苦平,有逐水祛痰、破積殺蟲之功效?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等活性[1]。國外膀胱癌的發(fā)病率在男性泌尿生殖腫瘤中僅次于前列腺癌,在我國則占首位。目前,國內(nèi)外采用綜合治療措施,藥物治療在其中發(fā)揮重要作用。國內(nèi)外學(xué)者在瑞香狼毒對肺癌、肝癌、宮頸癌等惡性腫瘤的研究中取得一定成果[2-4],但對泌尿系統(tǒng)如膀胱癌細(xì)胞的抗腫瘤研究少有報道。Survivin是近年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制因子,具有高度保守性和明顯抵抗細(xì)胞凋亡的作用,參與調(diào)控細(xì)胞分裂、增殖等過程[5]。Survivin在除胸腺外正常組織中不表達(dá),而在大部分腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[6]。Survivin基因作為一種凋亡抑制基因在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用[7-8],其表達(dá)情況與腫瘤的分級、分期密切相關(guān)[9-10],可以作為膀胱癌早期診斷及判斷預(yù)后的檢查指標(biāo)[11]。本實驗研究選擇人膀胱癌T24細(xì)胞株,給予膀胱癌T24細(xì)胞不同濃度瑞香狼毒處理后,觀察細(xì)胞的抑制率、凋亡率以及Survivin蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果顯示:瑞香狼毒水提取物對膀胱癌T24細(xì)胞具有明顯的抑制作用,具有濃度和時間依賴性。研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒水提取物促進(jìn)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡并下調(diào)Survivin蛋白的表達(dá)。
綜上所述,瑞香狼毒水提取物可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞增殖,其作用機(jī)制可能與Survivin蛋白表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。由于藥物促使腫瘤細(xì)胞凋亡是通過多條途徑共同作用的結(jié)果,因此需要進(jìn)一步深入研究,為開辟膀胱癌臨床治療新途徑提供理論依據(jù)。
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