費 嘉，張 儒，賈 陽

四珍力維膠囊是根據(jù)首長保障需要，由北京軍區(qū)總醫(yī)院制劑中心研制而成。本制劑主要由冬蟲夏草、西紅花、紅景天、西洋參等珍貴中藥材及有效部位群組成。經(jīng)實驗研究表明，本品具有活血化瘀、降低血液粘稠度、改善心腦血液循環(huán)、提高耐缺氧能力、補益心腦、滋陰壯陽、扶正固本、緩解人體疲勞、增強免疫力、雙向調(diào)節(jié)作用的功能，而且經(jīng)臨床實驗證實，本制劑能保護心肌及腦組織、抗冠心病、擴張血管、降低血壓，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用。此外，還有抗炎增智、降脂保肝、滋補強壯、抗疲勞、耐缺氧、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等作用。本文按照《中國藥典》2010年版一部附錄微生物限度檢查法的要求，對其微生物限度檢查方法進行探討。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 電熱恒溫干燥箱(上海滬南科學儀器廠)，LRH-250A生化培養(yǎng)箱(廣東醫(yī)療器械廠)，LRH-250生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，XG1-DI型手控小型滅菌器(山東新華醫(yī)療機械廠)，UV-1三用紫外燈(上海顧村電光儀器廠)，AEL-200天平(湘儀天平儀器設(shè)備有限公司)，WHCD-凈化工作臺(北京五環(huán)空調(diào)凈化工程公司)，JLQ-S1菌落計數(shù)器(無錫縣金城儀器廠)。

1.2 試藥 四珍力維膠囊(規(guī)格:每粒裝0.4 g，批號:060909，北京軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科制劑中心提供)。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus.)［CMCC(B)26003］，大腸埃希菌(Escherichia Coli.)［CMCC(B)44102］，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis.)［CMCC(B)63501］，白色念珠菌(Candida albicans.)［CMCC(F)98001］，黑曲霉(Aspergillus niger.)［CMCC(F)98003］，沙門菌(Salmonella.)(北京軍區(qū)藥檢所提供)。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號:050121)，改良馬丁培養(yǎng)基(批號:06121)，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號:050328)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號:060216)，曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基(批號:0503282)，膽鹽乳糖培養(yǎng)基(批號:050224)，MUG培養(yǎng)基(批號:050911)，改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(批號:070520)，四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基(批號:060510)，膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基(批號:060303)，pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號:050719)均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備 分別取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1 mL加9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至 10-5～10-7，菌數(shù)約為 50～100 cfu/mL;取經(jīng)25℃培養(yǎng)24～48 h的白色念珠菌霉菌改良馬丁培養(yǎng)物1 mL加9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10-5，菌數(shù)約為50～100 cfu/mL;取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，加3～5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液，用標準比濁管比濁，取比濁后的菌液1 mL加9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至 10-4，菌數(shù)約為 50～100 cfu/mL，做計數(shù)備用。

2.2 供試液制備 因供試品為貴重藥品，檢驗量由10 g酌減為3 g。取樣品3 g，加pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至90 mL，振搖使分散均勻，制成1∶30供試液，做計數(shù)備用。另取樣品1 g，加pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至10 mL，振搖使分散均勻，制成1∶10供試液，做控制菌檢查備用。

2.3 計數(shù)方法驗證

2.3.1 試驗組 根據(jù)四珍力維膠囊的組方特點以及理化性質(zhì)，我們采用了常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法進行計數(shù)方法的驗證。取1∶30供試液1.0、0.5和0.2 mL，加入平皿，隨后分別加入 50～100 cfu/mL的試驗菌，立即傾注不超過45℃的瓊脂培養(yǎng)基20 mL，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72 h觀察結(jié)果。

2.3.2 菌液組 取50～100 cfu/mL的試驗菌1 mL加入平皿中，立即傾注不超過45℃的瓊脂培養(yǎng)基20 mL，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72 h觀察結(jié)果，測定每一菌株的試驗菌數(shù)。

2.3.3 供試品對照組 取1∶30供試液1.0、0.5和0.2 mL，加入平皿中，立即傾注不超過45℃的瓊脂培養(yǎng)基20 mL，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72 h觀察結(jié)果，測定供試品本底菌數(shù)。

2.3.4 稀釋劑對照組 取pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1 mL和50～100 cfu/mL的試驗菌加入平皿中，立即傾注不超過45℃的瓊脂培養(yǎng)基20 mL，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72 h觀察結(jié)果。2.3.5 計數(shù)方法驗證結(jié)果 見表1。

表1 四珍力維膠囊微生物限度計數(shù)方法的驗證結(jié)果

從表1結(jié)果可見，四珍力維膠囊細菌計數(shù)方法的驗證采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2 mL/皿)，可消除供試品對人工污染枯草芽孢桿菌的抑制作用，回收率均高于70%。

2.4 控制菌檢查方法的驗證 本品為口服制劑，并且組方中含有動物藥以及藥材原粉，按照《中國藥典》一部的要求，需要對大腸埃希菌、大腸菌群和沙門菌進行檢查。

2.4.1 大腸埃希菌 (1)試驗組:取1∶10供試液10 mL、10～100 cfu/mL的大腸埃希菌1 mL分別加入100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18～24 h。依照大腸埃希菌的檢查方法檢查。(2)陰性菌對照組:采用金黃色葡萄球菌為陰性對照菌，檢查方法同試驗組。(3)陽性對照組:取10～100 cfu/mL的大腸埃希菌1 mL加入100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基，依法培養(yǎng)，檢查方法同試驗組。(4)陰性對照組:取pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液30 mL直接接種于100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，檢查方法同試驗組。

2.4.2 大腸菌群 (1)試驗組:取含10 mL的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基1管，加入1∶10的供試液1 mL(含供試品0.1 g)，再加入10～100 cfu大腸埃希菌，混勻，35℃培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果。(2)陰性菌對照組:采用金黃色葡萄球菌為陰性對照菌，檢查方法同試驗組。(3)陽性對照組:取含10 mL的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基1管，加入10～100 cfu大腸埃希菌，混勻，檢查方法同試驗組。(4)陰性對照組:取含10 mL的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基1管，加入稀釋液作為陰性對照管，混勻，35℃培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果。

2.4.3 沙門菌 (1)試驗組:取供試品10 g以及50～100 cfu/mL的沙門菌1 mL直接接種于200 mL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，攪拌混勻，35℃培養(yǎng)18～24 h后接種于10 mL四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18～24 h后，分別平板劃線，35℃培養(yǎng)18～24 h。依照沙門菌的檢查方法檢查。(2)陰性菌對照組:采用金黃色葡萄球菌為陰性對照菌，檢查方法同試驗組。(3)陽性對照組:取50～100 cfu/mL的沙門菌1 mL加入到200 mL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，攪拌混勻，檢查方法同試驗組。(4)陰性對照組:取200 mL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，檢查方法同試驗組。

2.4.4 控制菌檢查方法驗證的結(jié)果 見表2。從表2的結(jié)果可以看出:四珍力維膠囊控制菌項下的大腸埃希菌、大腸菌群和沙門菌的檢查法采用常規(guī)方法可正常檢出。

表2 四珍力維膠囊控制菌檢查方法的驗證結(jié)果(常規(guī)法)

2.5 微生物限度檢查方法的建立 根據(jù)上述驗證結(jié)果，四珍力維膠囊細菌計數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2 mL/皿)，以枯草芽孢桿菌為陽性對照菌進行檢驗，霉菌及酵母菌計數(shù)采用常規(guī)法檢驗;控制菌檢查項下的大腸埃希菌、大腸菌群和沙門菌的檢查可采用常規(guī)方法，依法檢驗。

3 討論

該制劑對枯草芽孢桿菌有較強的抑菌作用，提示該制劑對芽孢桿菌有較強的抑制作用，但是對真菌和革蘭陽性菌沒有抑制作用。本制劑可采用培養(yǎng)基稀釋法消除其抑菌作用，本方法用于微生物限度的檢查準確、有效。

［1］藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［S］.北京:化學工業(yè)出版社，2010:附錄79-88.

［2］中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2005:325-373.

［3］許華玉，杜蕓，錢文靜，等.藥品微生物限度檢查法中細菌和真菌計數(shù)方法的驗證試驗［J］.中國中藥雜志，2005，30(24):1918-1920.

［4］周修森，李道明.甲硝唑諾氟沙星栓微生物限度檢查方法研究［J］.中國醫(yī)藥導報，2010，7(4):42-44.

［5］趙建英，壽文虹，李愛玲.加強藥品無菌檢查和微生物限度檢查方法驗證的對策［J］.中國藥業(yè)，2008，17(8):6-7.