孟曉巖，丁 勇

1 儀器與方法

1.1 實驗儀器 Agilent-1100液相色譜儀(美國安捷倫公司，Agilent-1100系列四元泵，VWD檢測器，Agilent Chemstation色譜工作站);XK96-A型快速混勻器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司);DT-500型電子天平(常熟市衡器廠);AE200型電子分析天平(METTLER TOLEDO公司);SK7200H型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);0.45 μm過濾膜(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 試劑與藥品 對照品:綠原酸(753-9003)、咖啡酸(110885-200102)、蘆丁(100080-200306)、木犀草苷(111720-200501)，槲皮素(081-9903)均購自中國藥品生物制品檢定所;乙腈為色譜純;水為重蒸餾水;其他試劑均為分析純。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件和系統(tǒng)適應性實驗 色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)。流動相:乙腈-0.4%磷酸水溶液梯度洗脫，檢測波長:350 nm;柱溫:25℃;流速:1 mL/min;進樣量10 μL;綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素5個成分峰理論塔板數均不低于3 000，與相鄰峰的分離度大于2.0(見圖1)，梯度洗脫條件見表1。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸對照品5.2 mg，咖啡酸對照品4.1 mg，蘆丁對照品2.6 mg，木犀草苷對照品2.1 mg，槲皮素對照品2.5 mg，置25 mL棕色量瓶中。加10 mL甲醇溶解，超聲處理，放冷。加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為綠原酸 208 μg/mL、咖啡酸164 μg/mL、蘆丁104 μg/mL、木犀草苷84 μg/mL、槲皮素100 μg/mL的對照品混合溶液。

表1 梯度洗脫條件

圖1 金銀花供試品、對照品色譜圖

2.3 樣品溶液的制備 精密稱取藥材粉末(過40目篩)1 g置于100 mL圓底燒瓶中，精密加水50 mL，稱重，加熱回流1 h，放冷后再稱重，并用水補足重量差，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾即得。

2.4 線性關系考察 精密量取對照品混合溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL 置于 5 mL 容量瓶中，分別加入甲醇定容至5 mL，依次進樣10 μL測定，記錄色譜峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標、進樣量(X)為橫坐標，計算得回歸方程與線性關系見表2，結果表明，線性關系良好。

表2 線性關系及標準曲線測定結果

2.5 精密度試驗 將對照品混合溶液重復進樣5次，每次10 μL，記錄色譜峰面積。綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素的RSD分別為1.02%、1.09% 、1.26% 、1.18% 、1.02% 。

2.6 重復性試驗 精密稱取1 g金銀花樣品5份，按“2.1”項下方法測定并計算含量。金銀花樣品中綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素的RSD(n=5)分別為 1.12%、1.23%、1.25%、1.20%、1.10%。說明方法可靠，重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取對照品混合溶液，在0.5、2、4、6、8、10 h 進樣 10 μL，分別記錄 6 種成分的峰面積，綠原酸RSD為1.06%，咖啡酸RSD為1.10%，蘆丁RSD為1.19%，木犀草苷RSD為1.20%，槲皮素RSD為1.05%。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的藥材粉末約0.5 g，精密加入高、中、低濃度的混合對照液，每個濃度各做3份，按“2.1”項下方法，測定結果綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素的回收率分別為 97.50%(RSD=0.18%)、98.42%(RSD=0.44%)、99.30%(RSD=0.60%)、100.21%(RSD =0.26%)、99.44%(RSD=0.37%)。HPLC法同時測定金銀花中5種有效成分的準確度，見表3～表7。

2.9 樣品測定 取3批金銀花，按“2.3”項制得供試品液，分別將對照品溶液和供試品液注入液相色譜儀，進樣量為10 μL，記錄色譜峰面積，外標法計算含量。測定結果見表8。

表3 綠原酸對照品原液(208.0 μg/mL)

表4 咖啡酸對照品原液(164.0 μg/mL)

表5 蘆丁對照品原液(104.0 μg/mL)

表6 木犀草苷對照品原液(84.0 μg/mL)

表7 槲皮素對照品原液(100.0 μg/mL)

表8 樣品測定結果(%，n=2)

3 討論

3.1 測定波長的選擇 對綠原酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素對照品和金銀花樣品的70%乙醇提取液進行190～400 nm的紫外全波長掃描。綠原酸的最大吸收波長為327 nm，可接受檢測波長范圍280～360 nm;蘆丁的最大吸收波長為355 nm，可接受檢測波長范圍325～375 nm;木犀草苷的最大吸收波長為350 nm，可接受檢測波長范圍325～375 nm;槲皮素的最大吸收波長為370 nm，可接受檢測波長范圍360～390 nm。

由于當1個樣品中有數種UV圖譜不同的被測物時，不可能在最大波長處檢測各化合物。A＜0.1時，甚至在吸收譜帶陡坡上進行檢測，通常也符合線性關系。根據以上4種被測物的全波長掃描圖，選擇350 nm為4種物質同時測量的檢測波長?？Х人嵩?50 nm也有較大吸收，故選擇350 nm為檢測波長。

3.2 流動相的確立 金銀花中干擾成分眾多，樣品的處理及流動相的選擇都很重要。已有研究選擇不同［3-5］的流動相，分離效果均不理想。最后選用本文方法，確立最終流動相，即乙腈-0.4%磷酸水溶液。

3.3 本實驗建立的綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素在同一色譜條件下進行分析測定，可大大節(jié)省分析時間，提高效率。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社.

［2］石鉞，石任兵.我國藥用金銀花資源、化學成分及藥理研究進展［J］.中國藥學雜志，1999，34(11):724.

［3］楊蓓蓓，劉超，王素娟，等.高效液相色譜法測定金銀花藥材中3 種成分的含量［J］.藥物分析雜志，2006，26(2):168-171.

［4］李麗，田義杰，毛崇武，等.RP-HPLC測定金銀花3種成分的含量［J］.中成藥，2008，30(1):134-135.

［5］郭朝暉，蔣生祥.高效液相色譜法測定甘肅金銀花中槲皮素和木樨草素的含量［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17(4):552-553.

［6］趙國玲，劉佳佳，林丹，等.金銀花化學成分及藥理研究進展［J］.中成藥，2002，24(12):973-976.