邊 穎，王金春，商艷君

激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Kallikrein-kinin system，KKS)在人體內(nèi)分布較廣，可協(xié)調(diào)機(jī)體內(nèi)多種功能，如穩(wěn)定血壓、協(xié)調(diào)內(nèi)環(huán)境、抑制炎性反應(yīng)及促進(jìn)血管再生等［1］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能穩(wěn)定依賴KKS的調(diào)控［2］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)情況，用免疫組化染色的方法測(cè)定神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的表達(dá)，以證明其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的作用可能與NGF等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子有關(guān)，為進(jìn)一步臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 Wistar大鼠36只，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量270～300 g。將36只動(dòng)物隨機(jī)分為3組?？瞻讓?duì)照組:改良的Longa［3］栓線法制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型;鹽水對(duì)照組(NS組):大腦中動(dòng)脈閉塞后8 h，腹腔注射 NS 2 mL/(kg·d);TK治療組(TK組):右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞后8 h，腹腔注射TK 1 715 ×10-3U/(kg·d)。

1.2 MCAO模型的制作 取成年Wistar大鼠，體質(zhì)量270～300 g。10%水合氯醛0.35 g/kg，腹腔注射麻醉。小心剝離右側(cè)迷走神經(jīng)與頸總動(dòng)脈，結(jié)扎頸外與頸總動(dòng)脈，夾閉頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端，用針頭在近結(jié)扎線處刺入頸總動(dòng)脈，將直徑為0.26 mm的魚線插入頸總動(dòng)脈，前行入頸內(nèi)動(dòng)脈，距頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉處約1.8～2.0 cm感到有阻力時(shí)停止，即大腦中動(dòng)脈區(qū)。1 h后去除栓塞線。大鼠蘇醒后，若有追尾現(xiàn)象，原地轉(zhuǎn)圈，且向左側(cè)傾倒，右側(cè)Horner征，左前肢屈曲等即表明梗死模型成功。注意魚線不能插入過深，否則易致蛛網(wǎng)膜下腔出血。

2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.1 神經(jīng)功能缺失評(píng)分 實(shí)驗(yàn)前先對(duì)大鼠進(jìn)行訓(xùn)練，采用神經(jīng)損傷評(píng)分［4］(NSS)。術(shù)后第1天，NSS 8～12分的大鼠進(jìn)入本實(shí)驗(yàn)。術(shù)后第1、3、7天，對(duì)3組大鼠進(jìn)行評(píng)分及方差分析。

2.2 腦梗死體積測(cè)定 將大腦由額極至枕極分為5枚腦片，2 mm/片，立即置于2%TTC(紅四氮唑)溶液中，37℃水浴30 min，4%多聚甲醛固定30 min。顯微圖像分析系統(tǒng)采集每片腦切片上、下面圖像，分析每片腦切片上、下面腦梗死面積。根據(jù)梯形法則計(jì)算腦梗死體積。

2.3 免疫組化染色 梗死后3d，將大鼠用10%水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛心內(nèi)灌注后取腦，固定24 h，組織脫水包埋。在梗死灶中心部位，相當(dāng)于以前囟為中心，冠狀面 +1～-1 mm，每隔100 μm，連續(xù)7 μm 切片5張，對(duì)NGF進(jìn)行免疫組化染色。一抗為兔抗NGF(1∶200)，二抗為生物素化羊抗兔IgG。顯色底物為DAB顯色劑。

2.4 NGF測(cè)定 將染色后的腦組織切片取梗死周圍皮質(zhì)，進(jìn)行顯微圖像采集、分析(Meta Morph/DP10/BX41)，記錄經(jīng)過處理軟件包量化后的灰度值。2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件做方差分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 NSS評(píng)分 3組神經(jīng)功能缺損減輕。TK組第3天NSS評(píng)分與其他2組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組NSS評(píng)分()

表1 各組NSS評(píng)分()

注:*與TK組比較，P＜0.05;#與NS組比較，P＞0.05

組別 第1天 第3天 第7天空白對(duì)照組 9 8.90±1.12*#9 4.30±0.55 6.48±0.79 7.98±1.23 NS組 9 8.50±0.71* 7.56±0.85 TK組

3.2 動(dòng)物模型經(jīng)切片、TTC(紅四氮唑)染色 見圖1～圖2。

圖1 大鼠MCAO模型

圖2 大鼠MCAO模型

3.3 腦梗死體積的比較 3組均有梗死灶形成，但TK組梗死灶體積(30.54% ±3.47%)較NS組、空白對(duì)照組(38.43% ±5.73%，39.67%±4.98%)明顯減輕(P＜0.05)。

3.4 缺血區(qū)NGF免疫組化結(jié)果 大腦中動(dòng)脈閉塞后腦缺血區(qū)NGF增多，而注射TK后，NGF細(xì)胞明顯增多，TK組與其他2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2及圖3～圖4。

表2 各組腦組織切片中NGF灰度值比較()

表2 各組腦組織切片中NGF灰度值比較()

注:*與TK組比較，P＜0.05，#與NS組比較，P＞0.05

1d 3d 7d空白對(duì)照組 172.04±0.13*# 166.95±0.57 170.54±1.03*#組別NS組 173.10±0.24* 166.56±0.63*170.94±0.76*TK組166.32±0.37 154.64±0.51 160.86±0.38

圖3 NS組3d NGF的表達(dá)(400×)

圖4 TK組3d NGF的表達(dá)(400×)

4 討論

有學(xué)者提出，腦組織缺血性損傷早期，如果KKS受到激活而參與一系列的生理生化反應(yīng)，可以加重腦組織損傷，原因?yàn)镵KS增加通透性和腦水腫［6］。Zausinger等［7］研究顯示，在局灶性腦缺血前30 min給予激肽B2受體拮抗劑(LF16-0687MS)，可加快缺血性腦組織的功能恢復(fù)。另外，Xia等［8］提出，在腦組織缺血后 8 h，給予不同的治療，結(jié)果不同:注射人TK基因可使大鼠缺血性腦梗死的體積縮小;而LF16-0687MS能加重缺血性腦梗死的再灌注損傷。得出不同的結(jié)論與TK治療的時(shí)間有關(guān):TK在早期可使腦水腫加重，但后期卻能通過抑制細(xì)胞凋亡而起到神經(jīng)保護(hù)作用。倪耀輝等［9］研究顯示，在大鼠腦缺血再灌注后8 h給予TK，對(duì)腦缺血有明顯的治療作用，可減輕炎性反應(yīng)，同時(shí)還能降低梗死灶內(nèi)的細(xì)胞凋亡;明顯增加缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管上皮細(xì)胞的增生。因此，推斷TK是通過促進(jìn)血管、神經(jīng)組織再生以及抑制局灶缺血區(qū)的細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)而發(fā)揮治療作用［10-11］。

本研究顯示，在大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注后8 h注射TK，可改善大鼠的神經(jīng)功能缺損，并減少大鼠腦梗死體積，使腦缺血區(qū)NGF表達(dá)增多。結(jié)果表明，在腦缺血較晚期，TK有明顯的治療效果。另外，應(yīng)用TK治療能明顯增加缺血區(qū)的NGF表達(dá)，表明腦梗死時(shí)，TK有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生的作用。NGF能加速神經(jīng)元生長(zhǎng)、分化及維持其功能，在腦內(nèi)能保護(hù)神經(jīng)元抵御很多類型的損傷。因此，得出結(jié)論，通過保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)軸突再生而減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。這為臨床應(yīng)用TK治療缺血性腦梗死提供了重要的理論依據(jù)。

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