馬志軍，薛家祿，南清衛(wèi)，陳朝武，劉向陽，李建勛，別松濤

（1.河南利偉生物藥業(yè)股份有限公司，河南 焦作454850；2.天津科技大學 工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津300457）

膽固醇，也稱膽甾醇，是一種天然的甾體資源，是合成維生素D3的主要原材料，廣泛應用于化妝品、醫(yī)藥等領域[1］。美國CTFA（化妝品香料香精協會）化妝品原料手冊已將膽固醇列為可加入化妝品的天然活性物質。

膽固醇在羊毛脂中含量很高，而我國羊毛脂資源豐富，因此，研究從羊毛脂中提取膽固醇意義重大。目前，從羊毛脂中提取膽固醇主要采用色譜法、溴化法、分子蒸餾法、超臨界萃取法、溶劑選擇結晶法和配合法等化學方法[2］，均用到了有機溶劑，不符合生態(tài)環(huán)保的科學理念[3］。

作者以羊毛脂為底物篩選菌株，利用篩選到的菌株對羊毛脂進行微生物轉化制備膽固醇，并對發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。

1 實驗

1.1 土壤樣品與培養(yǎng)基

土壤樣品采集自洗毛廢棄物傾倒處和膽固醇生產工廠。

PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯汁1000mL，葡萄糖20g，瓊脂20g，羊毛脂30g，121℃高壓滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糖90g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，水1000mL，pH值7.6。

1.2 材料、試劑與儀器

羊毛脂，江陰星鵬化工有限公司。

三氯甲烷，東營富隆化工有限公司；硫酸，江蘇索普有限公司；標準膽固醇（色譜級），美國Sigma公司；乙腈、異丙醇、95%乙醇、無水乙醇、正己烷、乙醚、石油醚（30～600℃），市售。

N2000色譜工作站：杭州億捷科技有限公司。色譜條件：LC－10ATVP PLUS Wondersil C18色譜柱；流動相為乙腈－異丙醇（4∶1，體積比）；柱溫40℃；流速0.6mL·min－1；檢測波長210nm；進樣量10μL。

1.3 方法

1.3.1 菌株的篩選與鑒定

取土壤樣品1.0g，置于已消毒的試管中，加入無菌水10mL后以渦旋振蕩器振蕩搖勻，靜置，取上層清液，滴于PDA平板培養(yǎng)基上，以玻璃棒涂勻，置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5d，待平板上長出菌落后，挑出單菌落于準備好的PDA平板培養(yǎng)基上，根據形態(tài)特征判斷純的菌株，編號保存。

將分離得到的菌株分別接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中，待長出單菌落后，取菌落下面的培養(yǎng)基1.0g置于試管中，加入三氯甲烷10mL并振蕩，使培養(yǎng)基中可能存在的膽固醇充分溶解，再加入10%濃硫酸10mL。觀察三氯甲烷層若呈血紅色，則推測此菌株具備轉化能力；若不呈血紅色，則不具備轉化能力[4］。將獲得的具有轉化能力的菌株編號N0012。

將菌株N0012在分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并用顯微鏡進行鑒定。

1.3.2 羊毛脂微生物轉化制備膽固醇

以篩選獲得的菌株N0012進行半固體平板培養(yǎng)較長時間，取菌落下的培養(yǎng)基0.5g于具塞試管中，加入5mL 95%乙醇，充分振蕩；然后加入10mL乙醚，振蕩；再加入10mL石油醚，充分振蕩后靜置使液層分離。取上層有機相1.0mL用氮氣吹干，并以0.5mL無水乙醇溶解進行HPLC分析。

2 結果與討論

2.1 菌株的鑒定

實驗發(fā)現，篩選獲得的菌株在分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落質地致密、表面呈較緊密的絨狀、堅實、干燥、多皺，可初步判斷菌株為放線菌。在顯微鏡下觀察，細菌呈分枝絲狀，可進一步確定菌株為放線菌[5］。

2.2 HPLC分析（圖1）

圖1 膽固醇標準品（a）和羊毛脂轉化產物（b）的HPLC圖譜Fig.1 The HPLC chromatograms of cholesterol standard（a）and the transformation product of wool grease（b）

由圖1可知，羊毛脂轉化產物與膽固醇標準品的出峰時間基本相同，表明通過微生物轉化獲得了膽固醇。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 發(fā)酵pH 值（圖2）

圖2 發(fā)酵pH值對膽固醇產量的影響Fig.2 The effect of fermentation pH value on cholesterol production

由圖2可知，發(fā)酵pH值為7.6時，膽固醇產量最高。故選擇適宜的發(fā)酵pH值為7.6。

2.3.2 發(fā)酵溫度（圖3）

由圖3可知，發(fā)酵溫度為30℃時，膽固醇產量最高。故選擇適宜的發(fā)酵溫度為30℃

。2.3.3 發(fā)酵時間（圖4）

由圖4可知，發(fā)酵110h時的膽固醇產量最高。故選擇適宜的發(fā)酵時間為110h。

2.3.4 碳源

碳源添加量為10g·L－1、固定其它條件，考察葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、糊精、乳糖、可溶性淀粉等不同碳源對膽固醇產量的影響，結果見圖5。

圖5 不同碳源對膽固醇產量的影響Fig.5 The effect of different carbon sources oncholesterol production

由圖5可知，以麥芽糖為碳源時，膽固醇產量最高。故選擇最適碳源為麥芽糖。

麥芽糖濃度對膽固醇產量的影響見圖6。

圖6 麥芽糖濃度對膽固醇產量的影響Fig.6 The effect of maltose concentration on cholesterol production

由圖6可知，麥芽糖濃度為90g·L－1時，膽固醇產量最高。故選擇適宜的麥芽糖濃度為90g·L－1。

2.3.5 羊毛脂濃度（圖7）

圖7 羊毛脂濃度對膽固醇產量的影響Fig.7 The effect of wool grease concentration on cholesterol production

由圖7可知，羊毛脂濃度為80g·L－1時，膽固醇產量最高。故選擇適宜的羊毛脂濃度為80g·L－1。

3 結論

（1）從土壤中篩選到一株可將羊毛脂轉化為膽固醇的菌株，經形態(tài)學分析確定其為放線菌。

（2）以羊毛脂為底物微生物轉化制備膽固醇，其最佳發(fā)酵條件如下：發(fā)酵pH值7.6、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間110h、碳源麥芽糖濃度90g·L－1、羊毛脂濃度80g·L－1，在此條件下，膽固醇產量達到516mg·mL－1。

[1]Lower E S.Cholesterol in cosmetic formulation—A review [J］.Drug ＆ Cosmetic Industry，1975，116（5）：54－57.

[2]胡芬，譚蘭蘭，楊景昌，等.從羊毛醇中提取膽甾醇的工藝研究[J］.化學研究與應用，2008，20（11）：1441－1446.

[3]Truter E V.The extraction of cholesterol from wool wax alcohol[J］.Manufacturing Chemist，1955，26（3）：231－235.

[4]國家藥典委員會.中國藥典[M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：57－58.

[5]阮繼生，黃英.放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類[M］.北京：科學出版社，2011：254－258.